Isolation of caveolae using affinity two-phase partitioning

Abstract: Popular Abstract in Swedish Målsättningen för detta arbete var att isolera caveolae för att kunna studera deras struktur och funktion. Caveolae är omegaformade inbuktningar i cellmembranet, ungefär 50-150 nm i diameter. Caveolae finns i många typer of celler, men inte i röda och vita blodkroppar eller nervceller. Man tror att de har flera viktiga funktioner. Exempelvis kan caveolae transportera molekyler mellan olika regioner av cellmembranet och även till membraner inne i cellen. Caveolae är också ett viktigt element i överföringen av signaler från cellens omgivning till dess inre. Än så länge vet man inte om caveolae utför liknande funktioner i olika organ i kroppen eller om funktionerna skiljer sig åt. Den vanliga isoleringsmetoden för caveolae är baserad på att lösgöra dem från isolerade cellmembraner och sedan rena dem genom centrifugering i täthetsgradienter. Caveolae karakteriseras med hjälp av caveolin som är ett protein som finns i caveolaemembranet. Kolesterol och sfingolipider är viktiga lipider i detta membran, vilket gör det olösligt i vissa detergenter. Detta utnyttjas för att lösa ut caveolae från andra delar av cellmembranet. Isolerade cellmembraner används som startmaterial för att rena caveolae. Här har en alternativ metod använts som går ut på att rena membranerna i s.k. tvåfassystem. Ett tvåfassystem består av två polymerlösningar i vatten som inte är blandbara. Dessa lösningar bildar två faser ungefär som olja och vatten. Olika membraner fördelar sig olika i ett sådant tvåfassystem och kan separeras från varandra på det sättet. För att förbättra reningen av cell membraner har ett sockerbindande protein, ett s.k. lektin som isolerats från vetegroddar, kopplats till den ena faspolymeren. Eftersom lektiner binder till sockerrester som finns på ytan av cellmembranet styr man cellmembranet till den fas som innehåller lektinet. Proceduren kallas affinitetsrening. Caveolae kan sedan lösas ut från cellmembranet med detergenter. För att rena caveolae har en ny metod utarbetats som också bygger på tvåfasseparation och affinitetsfördelning. Här används antikroppar som känner igen caveolinet i caveolae för att styra caveolae till en av faserna i tvåfassystemet. Affinitetsfördelning är en bra och snabb metod för rening av caveolae. Metoden kan också utnyttjas för isolering av andra membraner genom att byta till antikroppar som är riktade mot ytproteiner i dessa membraner. Vi har alltså utvecklat alternativa tekniker för att isolera cellmembraner och caveolae för att kunna studera caveolaes exakta roll i celler. Exempelvis kan man studera sådana transportmekanismer i caveolae som utnyttjas av malaria- och sömnsjukeparasiter för att ta sig in i cellen. Även koleratoxin tas upp på samma sätt. Det är därför av intresse att rena caveolae för att kunna studera deras funktioner och därmed försöka lära sig styra sådana transportmekanismer.