Regulation and functions of basic helix-loop-helix transcription factors in neuroblastoma cells

Abstract: Popular Abstract in Swedish En av de viktigaste frågeställningarna inom molekylär genetik är hur uttrycket av människans ca 30-40 000 gener regleras i tid och rum. En typ av reglering som är väldigt viktig är transkriptionell reglering och denna utövas av proteiner som kallas transkriptionsfaktorer. Dessa binder till specifika områden i DNA strängarna i närheten av genkodande regioner och kan därigenom aktivera eller hämma genuttryck. bHLH (basiska helix-loop-helix) proteiner är en typ av transkriptionsfaktorer som är inblandade i bl.a. utmognaden av vissa celltyper, såsom t.ex. nervceller och muskelceller. Den basiska delen kan binda till DNA och HLH delen kan förmedla parbildning mellan proteiner. bHLH transkriptionsfaktorer delas in i olika grupper beroende på uttrycksmönster samt funktion. Till klass A proteinerna hör de så kallade E proteinerna som uttrycks i många olika vävnader i kroppen, och till klass B proteinerna, som har ett mer vävnadsspecifikt uttryck, hör t.ex. transkriptionsfaktorerna HASH-1, dHAND och MyoD. Förutom dessa olika typer av bHLH proteiner finns det även en grupp som saknar den basiska delen av bHLH domänen, de sk Id proteinerna. Id proteinerna binder till vissa bHLH proteiner och förhindrar dessa att binda in till DNA och aktivera eller hämma uttrycket av olika gener. Vägen till bildandet av en tumör är väldigt komplex och innebär en successiv ackumulering av genetiska förändringar. Det har visats att dessa förändringar oftast sker i ett litet och begränsat antal gener och karaktäriseringen av dessa är och har varit ett av de största problemen som man försöker att lösa inom molekylär genetik. När kroppens kontrollsystem, som reglerar celldelning samt celldöd, sätts ur spel kan missbildningar eller tumörer uppstå. Neuroblastom är en barntumör som bildas från celler i det sympatiska nervsystemet och som drabbar i genomsnitt 14 barn per år i Sverige. Det sympatiska nervsystemet, som tillhör det autonoma nervsystemet, kontrollerar funktioner som inte kan styras av viljan och som är viktiga vid bland annat stress och fara. Neuroblastom kan ge mycket varierande symptom och är dessutom relativt sällsynt, vilket ofta leder till att sjukdomen upptäcks och behandlas väldigt sent. Trots att effektiva behandlingsformer har kunnat arbetats fram för många andra sorters barncancer, har vissa former av neuroblastom fortfarande en väldigt dålig prognos. Behandlingen består av, cellgifter och/eller strålbehandling och om möjligt avlägsnande av tumören. Ungefär hälften av de barn som har fått diagnosen neuroblastom överlever. I min avhandling har jag i huvudsak studerat reglering och funktion av olika neuronala bHLH transkriptionsfaktorer i neuroblastom och vid neuronal utmognad. Vi har till stor del fokuserat på HASH-1, som är en bHLH transkriptionsfaktor som normalt sett bara uttrycks under fosterutvecklingen. HASH-1 uttryck kan detekteras i det sympatiska nervsystemet fram till och med fostervecka 7, därefter kan man inte hitta något uttryck i det sympatiska nervsystemet. Trots detta kan HASH-1 uttryck hittas i flertalet neuroblastomtumörer, vilket kan betyda att tumörcellerna har ”fastnat” på ett tidigt utvecklingsstadium och kan därför fortsätta att dela sig. Beroende på vilka proteiner som binder till varandra kan man få olika effekt och resultat, dvs olika specificitet, samt hämning eller aktivering av genuttryck. Eventuellt skulle HASH-1 kunna ha en viktig och avgörande roll i den blockerade utmognaden av neuroblastomceller och det skulle därigenom vara av stor betydelse att utreda vilka proteiner som interagerar med HASH-1. Därför har vi i arbete I och III fokuserat på att hitta proteiner som binder till HASH-1 och eventuellt påverkar dess funktion. Initialt använde vi oss av jäst två-hybrid systemet, som är ett eukaryot system för att studera protein-protein interaktioner in vivo. Vi använde oss av HASH-1 som bete för att kunna ”fiska” ut interagerande proteiner ur ett cDNA bibliotek från en neuroblastom cellinje. I ett cDNA biblioteket finns olika typer av proteiner som uttrycks i en specifik celltyp. Denna studie visade att HASH-1 interagerade med E2-2, ett E protein och ubiquilin-1, ett ganska nyligen upptäckt protein. Både E2-2-HASH-1 interaktionen och ubiquilin-1-HASH-1 interaktionen konfirmerades i mammalie celler. Det har tidigare visats att HASH-1 kan interagera med E12, ett annat E protein och detta komplex kan binda in till gener och aktivera dessas uttryck. Vi ville därför titta närmare på om HASH-1-E2-2 komplexet kunde aktivera gener, vilket vi kunde påvisa i arbete I. Vi fann även att E2-2 kan binda till sig själv, men detta komplex kunde inte aktivera den ”reportergen” som vi hade valt att studera. Vi kunde även i detta arbete visa att HASH-1 inte binder till sig själv. Det finns några få artiklar publicerade om ubiquilin-1, ett protein som inehåller ett antal ubiquitin-relaterade delar. Det är ett litet protein som kopplas till andra proteiner och dessa bryts därigenom ned via ett system som kallas 26S proteosom maskineriet. Även ubiquilin-1 har visat sig vara involverad i reglering av proteinnedbrytning, men i detta fall ser det ut som om ubiquilin-1 skyddar mot nedbrytning. Så verkar det vara även i HASH-1-ubiquilin-1 fallet som vi har studerat i arbete III. När HASH-1 och ubiquilin-1 överuttrycktes i celler, ledde detta till att HASH-1 nivåerna gick upp. Samma typ av experiment upprepades ännu en gång, HASH-1 och ubiquilin-1 överuttrycktes var för sig samt tillsammans. I detta fallet behandlades cellerna med inhibitorer som blockerar nedbrytningen av proteiner via 26S proteasom maskineriet. HASH-1 nivåerna ökade vid proteosominhibitor behandling, samt vid överuttryck tillsammans med ubiquilin-1. Alltså HASH-1 bryts ned via 26S proteasom systemet vid överuttryck i denna cellinje och ubiquilin-1 skyddar HASH-1 mot nedbrytning. Ubiquilin-1 nivåerna påverkades inte av proteosominhibitor behandlingen. I ett annat experiment exponerade vi neuroblastomcellinjen SK-N-BE(2) för proteosominhibitorer. I detta fallet fick vi till vår stora förvåning en minskning av HASH-1 proteinnivåerna, vilket tyder på att HASH-1 uttrycket regleras annorlunda i dessa celler. I nästa steg ville vi därför analysera ett annat bHLH protein, HES-1, som hämmar HASH-1 uttryck. Det visade sig att HES-1 nivåerna gick upp vid proteosominhibitor behandling, vilket kan vara orsaken till att HASH-1 nedreglerades i dessa celler. Interaktionsmönstret mellan olika HLH proteiner är långt ifrån klarlagt. För att få en lite klarare bild av detta studerade vi i arbete II interaktioner mellan olika neuronala bHLH proteiner och de fyra humana Id proteinerna genom att använda mammalie två-hybrid systemet. Detta är ett system som man kan använda för att studera om proteiner interagerar. Alla fyra Id proteinerna band till HES-1 samt E proteinerna E47 och E2-2, men däremot inte till HASH-1 eller dHAND. Interaktionen mellan E proteinerna och Id är redan etablerad, men HES-1-Id interaktionen har inte tidigare varit känd. Vi visade även att HES-1s inbindning till DNA kan hämmas genom tillsats av Id2 protein. Detta sker troligtvis genom att HES-1 och Id2 bildar ett par som ej kan binda till DNA p.g.a. att Id2 saknar den DNA bindande basiska domänen. Vi studerade även hur uttrycket av de olika Id proteinerna påverkades vid utmognad av neuroblastomceller. Det visade sig att Id1-Id3 nedreglerades vid denna utmognad. Ett högt uttryck av Id proteinerna kan vara viktigt för att upprätthålla celldelningen i neuroblastomcellerna och därmed förhindra utmognaden av dessa. Olf/EBF (O/E) proteiner tillhör den ganska nyligen definierade Collier/Olf-1/EBF (COE) familjen. Denna familj liknar, strukturellt sett, bHLH proteinerna. Om, och isåfall hur, det finns ett funktionellt samband mellan bHLH och COE proteiner i utvecklingen av nervceller har studerats ytterst bristfälligt. I arbete IV ville vi därför titta närmare på uttrycket av O/E i olika neuroblastomcellinjer och hitta nya målgener för O/E i dessa celler. O/E-1 och O/E-2 uttrycktes i alla de undersökta neuroblastomcellinjerna, i motsats till O/E-3 som endast uttrycktes i en neuroblastomcellinje. Därefter ville vi titta på uttrycket av O/E-1 och O/E-2 vid differentiering och behandlade därigenom en neuroblastomcellinje, SK-N-BE(2), med en substans som gör att cellerna utmognar neuronalt. Vi fann att O/E-1 och O/E-2 uppreglerades vid denna inducerade differentiering av SK-N-BE(2) celler. Därefter valde vi ut några nervcellsspecifika gener för att studera om O/E eventuellt kunde binda in till dessa och på detta sätt reglera dessa geners uttryck. Genbitarna märktes in radioaktivt och blandades med O/E-1 protein. Genom att låta denna blandning vandra genom en icke denaturerande gel kan man se om det bildas ett komplex mellan proteinet ifråga och DNA bitarna. Denna metod kallas EMSA. Det visade sig att O/E-1, men även andra O/E proteiner, kan binda in till två nervcellsspecifika gener, nämligen SCG10 samt Chromogranin A.