Involvement of Heparan Sulphate Biosynthesis and Turnover in Cell Proliferation. A Novel Role for Nitric Oxide in Recycling of Heparan Sulphate Proteoglycans

Abstract: Popular Abstract in Swedish Proteoglykaner (PG), framför allt sådana som bär glykosaminoglykan-sidokedjor av heparansulfat (HS) typ, utgör multifunktionella receptorer på cellytan och i pericellulär matrix hos alla adherenta celler i högre organismer. HS-proteoglykaner är inblandade i många olika cellprocesser, bl.a. koagulation, celltillväxt, och aktivering av enzymer, antienzymer samt bindning till olika matrixproteiner. HS påverkar och reglerar cell tillväxt genom att binda olika tillväxtfaktorer (Bernfield et al., 1999). Olika HS varianter har beroende på sin struktur hämmande eller stimulerande effekt. Speciell intressant är att FGF binder till vissa sekvenser i HS-kedjorna, vilket stimulerar FGF att aktivera den signalförmedlande receptorn (Guimond et al., 1993). Det har visats att vissa former av HS kan utöva en direkt antiproliferativ effekt (Westergren-Thorsson et al., 1991; 1993). Tumörceller bär också på sin yta proteoglykaner av HS-typ. En familj som kallas glypikan uttrycks i ökad mängd vid malign transformation (Bernfield et al., 1999). En annan karakteristisk tumörcellsprodukt är enzymet endoheparanas (HS-as) som partiellt fragmenterar HS. Detta underlättar nedbrytningen av basalmembran, som innehåller en annan HSPG, perlekan, samt frisättningen av FGF från sin vävnadsreservoir. Denna faktor verkar både chemotaktiskt och tillväxtstimulerande på vaskulära endotelceller. Proteoglykaner kan vara integrerade i plasmamembranen via penetrerande hydrofoba peptidsegment (t.ex. syndekaner och betaglykan) eller kovalent bundna till plasmamembranen via ett glykosylfosfatidylinositol-ankare, kallat GPI (en sådan PG familj är glypikanerna med 6 isoformer till dags dato). De flesta cellyte-PG är substituerade med HS men även chondroitinsulfat (CS) förekommer. Glykanerna är kovalent kopplade till proteinet via en gemensam GlcA-Gal-Gal-Xyl sekvens där Xyl är bundet till OH-gruppen på serin. HS-kedjan byggs på som en polymer av (-4GlcAb1-4GlcNAca1-)n där n varierar från ca 50 till kanske 200. Genom olika modifikationer, såsom utbyte av NAc mot NSO3, epimerisering av GlcA till IdoA och substitutioner med OSO3 på C3/C6 i GlcN och C2/C3 i GlcA/IdoA, vilket sker i varierande grad i olika sektioner av polymeren, skapas ett stort antal sackaridsekvenser (Lindahl et al., 1998). HS degraderas av speciella endoheparanaser lokaliserade till endosomer och dessa enzymer är speciellt aktiva i tumörceller (Nakajima et al., 1988). HS i extrakt av humana umbilikalvenendotelceller (HUVEC) degraderas under betingelser som pekar på en icke-enzymatisk degradation (Lindblom et al., 1989; Lindblom, 1991). Endotelceller producerar kväveoxid (NO) från arginin med hjälp av NO-syntas (eNOS). NO, som är en välkänd signalssubstans har kort livslängd eftersom den oxideras vid kontakt med syre, varvid bl.a. nitrit (NO2-) bildas (Wink et al., 1996). NO2- i sin tur degraderar HS genom deaminativ klyvning. Vilar et al. (1997) fann att HUVEC genererar tillräckliga mängder NO2- för att kunna degradera exogent tillfört HS. Man har också påvisat förhöjd NO-produktion i tumörer (Doi et al., 1996; Thomsen and Miles, 1998). Glypikan-1 (HSPG) kan internaliseras och recirkulera tillbaka till cellytan. Under passagen genom cellen (troligen via endosomer och Golgi) sker en degradering av HS-kedjorna följt av en återuppbyggnad av nya HS-kedjor (Fransson et al., 1995; Edgren et al., 1997). Vi har funnit att transformerade vaskulära endotelceller (ECV) uttrycker glypikan-1. Den förekommer huvudsakligen som protein med korta HS-stumpar, samtidigt som en betydande pool av HS-oligosackarider finns i cellerna (delarbete II). Vid blockering av recirkulationen med (a) brefeldin A, (b) heparanas-hämmaren suramin eller (c) NOS-hämmare och sulfamat (nitritförstörare) ansamlas (a) intakt glypikan-PG respektive (b och c) partiellt HS-degraderade former. Den inledande klyvningen synes ske intill GlcN med fri aminogrupp. Vi har också funnit att recirkulation av glypikan, efter endogen degradation av HS-delen, uteblir om ECV behandlas med NOS-hämmare eller sulfamat. Efter tillförsel av NO återbildas glypikan-PG från de degraderade formerna (delarbete II). Fortsatta studier har visat att de fria NH2-grupperna är samlade till en region nära proteinändan (delarbete III). Vi har även funnit att en viss naphtol-innehållande xylosid kan selektivt hämma celldelningen i tumörceller och transformerade celler (delarbete I). Varken motsvarande L-xylosid, som inte initierar HS-syntes, eller xylosider som enbart initierar CS-syntes, har någon effekt på celldelningen inom motsvarande koncentrationsintervall. I ett samarbete med avd. för org. kemi, LTH har vi testat en rad syntetiska xylosider där aglykonens struktur varieras på systematisk sätt. En förutsättning för tillväxthämmande effekten synes vara att xylosiden bär hydroxylgrupper i aglykondelen och att den leder till syntes av HS som senare degraderas av nitrit (delarbete IV).