On CXC Chemokines in Endotoxin-Induced Liver Injury

Abstract: Popular Abstract in Swedish Vid en infektion aktiveras vårt immunförsvar och sätter igång ett inflammatoriskt svar med uppgift att eliminera de främmande mikroberna. Det inflammatoriska svaret är nödvändigt för vår överlevnad och en naturlig del av all läkning. I vissa situationer kan dock inflammationen i sig bli för kraftig och orsaka skada på värdens egen vävnad. Ett dysreglerat eller alltför kraftigt inflammatoriskt svar ligger bakom flera av våra folksjukdomar, så som reumatism, astma, inflammatoriska tarmsjukdomar och psoriasis. Vid dessa tillstånd angriper immunförsvarets egna celler, exempelvis de vita blodkropparna (leukocyterna), kroppsegen vävnad som skadas i processen. Ett annat sådant tillstånd är sepsis (blodförgiftning) då det inflammatoriska svaret blir alltför kraftigt och bidrar till sjukdomsprogressen. Rekryteringen av vita blodkroppar från blodbanan ut i vävnaden är en fundamental del av det inflammatoriska svaret. Vid en infektion aktiveras både leukocyterna och celler i kärlväggen (endotelceller) av signalsubstanser, bl.a. kemokiner, från infekterad vävnad, och av bakterierna och deras produkter, exempelvis endotoxiner. Denna aktivering leder till att leukocyterna och endotelcellerna uttrycker molekyler, s.k. adhesionsmolekyler, som gör att leukocyterna kan fångas upp av endotelcellerna, rulla längs med kärlväggen, fastna på kärlväggen i närheten av vävnadsskadan, ta sig mellan endotelcellerna och slutligen vandra in i vävnaden. Målet med denna avhandling var att definiera några av mekanismerna bakom leverskada orsakad av LPS, en av de vanligast förekommande endotoxinerna vid sepsis. Tidigare arbeten har föreslagit flera olika adhesionsmolekyler som viktiga för leukocytadhesionen i levern. Det har dock inte varit känt vilken molekyl som är viktigast för att leukocyterna ska kunna fastna på kärlväggen och sedan ta sig in i vävnaden. I det första delarbetet undersöktes en av dessa molekyler, LFA-1. Med blockerande antikroppar och möss utan den kodande genen för LFA-1 jämfördes leukocytadhesionen efter behandling med LPS. Intressant nog fanns det lika många leukocyter som rullade i kärlen, men anti-LFA-1- behandling ökade rullningshastigheten. Det visade sig att knappt hälften så många leukocyter fastnade på kärlväggen om LFA-1 hade blockerats eller inte kunde uttryckas. Vidare hade LFA-1 stor betydelse för utveckling av LPSinducerad leverskada. Både möss behandlade med antikroppen och möss utan fungerande LFA-1 hade c:a 70% lägre ASAT- och ALAT-värden. Dessutom skyddades levercellerna från programmerad celldöd (apoptos). Fria syreradikaler (Reactive oxygen species, ROS) bildas vid olika former av vävnadsskada, framför allt vid ischemi, och har visat sig ha betydelse för det inflammatoriska svaret och leukocytrekryteringen. Vilken roll ROS spelar vid LPS-inducerad leverskada har dock inte varit känt. I det andra arbetet förbehandlades en grupp djur med allopurinol, en xantinoxidashämmare som blockerar bildningen av ROS. Det visade sig att denna behandling effektivt skyddade mot ökad leukocytadhesion, leverskada och apoptos. Dessutom förbättrades blodcirkulationen i sinusoiderna, leverns kapillärer. Vi kunde alltså visa att ROS spelar en viktig roll för utvecklingen av leverskada orsakad av LPS. För att undersöka sambandet mellan leukocytrekrytering och ROS, analyserades även kemokinuttrycket efter LPS-administration med och utan allopurinolbehandling. Intressant nog visade det sig att uttrycket av både KC och MIP-2, kemokiner som reglerar neutrofilrekryteringen, var betydligt lägre i djur som förbehandlats med allopurinol. Detta delarbete påvisar sålunda en länk mellan ROS och leukocytrekrytering. Det är väl känt att kemokinerna är viktiga signalsubstanser för leukocyternas rekrytering till vävnaderna. Huruvida de behövs för LPS-orsakad leverskada har däremot varit oklart. Målet med det tredje delarbetet var därför att klargöra sambandet mellan leukocytrekryteringen, leverskada och kemokiner. Först visades att kemokinuttrycket ökade kraftigt efter LPS-administration. Med immunohistokemi visades att kemokinerna framför allt fanns kring hepatocyterna, och därigenom möjligen skapar en kemotaktisk gradient mellan levercellerna och kärlen. Vi förbehandlade sedan djur med monoklonala antikroppar riktade mot MIP-2 och KC, och fann att båda dessa behandlingar skyddade mot leverskada och hepatocytapoptos. Detta kunde bekräftas med histologi, som visade på närmast intakt levervävnad i de förbehandlade grupperna. Däremot var leukocytrullningen och leukocytadhesionen oförändrat hög i grupperna som förbehandlats med de blockerande antikropparna. Det verkar som om kemokinerna behövs för att leukocyterna ska ta sig ut i vävnaden. I det sista delarbetet använde vi en syntetisk anti-inflammatorisk substans, Linomide, som har visat sig ha god effekt vid ett flertal inflammatoriska sjukdomar. Den exakta verkningsmekanismen är inte känd, men det har föreslagits att Linomide nedreglerar pro- och uppreglerar anti-inflammatoriska cytokiner. Förbehandling med Linomide visade sig skydda mot LPS-inducerad leukocytrekrytering, leverskada och apoptos av leverceller. Dessutom minskade uttrycket av kemokinerna MIP-2 och KC av förbehandlingen. För att försöka förstå mekanismen bakom effekten mätte vi även nivåerna av den anti-inflammatoriska cytokinen IL-10. Det visade sig att IL-10-uttrycket ökade kraftigt av Linomide-förbehandlingen. Det är således möjligt att det är främst genom uppreglering av IL-10 som Linomide verkar anti-inflammatoriskt. För att undersöka detta närmare behandlades djur utan IL-10-genen först med Linomide och sedan med LPS. Intressant nog hade Linomide ingen skyddande effekt hos dessa djur som saknade IL-10. Tvärtom var leverskadan snarast värre. Därmed kunde vi slå fast att Linomide verkar genom att uppreglera IL-10. Sammanfattningsvis har denna avhandling karaktäriserat och identifierat flera viktiga mekanismer involverade i endotoxin-orsakad leverskada. LFA-1 visade sig vara viktig för leukocytadhesionen och behövs för utvecklingen av leverskadan. Även fria syreradikaler är inblandade i patofysiologin, och viktiga för bland annat leukocytrekryteringen och kemokin-uttrycket. Kemokinerna är essentiella för att leukocyterna ska kunna komma ut i vävnaden och orsaka vävnadsskada, men inte för leukocytrullning eller adhesion i venolerna. Slutligen visade sig Linomide ha god skyddande effekt på leukocytrekryteringen och leverskadan orsakad av LPS, bland annat genom uppreglering av den antiinflammatoriska cytokinen IL-10. Resultaten kan förhoppningsvis öka förståelsen för de patofysiologiska mekanismerna vid septisk leverskada, och därmed bidra till utvecklingen av nya och effektiva behandlingsmetoder.