Ultrasound-enhanced Fibrinolysis Pro-fibrinolytic and Non-beneficial Effects Of Ultrasound Exposure

Abstract: Popular Abstract in Swedish Ultraljud används inte bara som ett diagnostiskt hjälpmedel utan också som en behandlingsmetod. De terapeutiska områden som utforskas idag är destruktion av cancertumörer, behandling av diskbråck, ökning av antibiotikaeffekter, ökning av cellgiftseffekter och som i detta arbete, ökning av effekterna av propplösande läkemedel. Det görs även försök där ultraljud används för att lösa blodproppar utan propplösande läkemedel, då används enbart ultraljud eller en kombination av mikrobubblor och ultraljud. De effekter som åstadkoms vid ultraljudsexponering har tidigare förklarats bero på faktorer som, temperaturökning, ultraljudsinducerad strömning och kavitationseffekter. Ultraljud har visats kunna påverka fibrinnätverket så detta blir mer känsligt för propplösande läkemedel, kunna öka transporten av läkemedel in i blodproppen samt öka bindningen av läkemedel i blodproppen. De faktorer som är involverade i samband med ultraljudsförstärkt blodproppsbehandling är dock inte helt klarlagda. Syftet med denna vetenskapliga studie var att undersöka olika ultraljudsparametrars effekter på två olika blodproppslösande läkemedel, samt att utvärdera om de ultraljudsparametrar som verkar positivt på blodproppslösande behandling kan ge upphov till skadliga effekter på hjärt- och hjärnvävnad som ultraljudsexponeras vid en behandling. Detta gjordes genom att utvärdera: ·förändringar i de propplösande effekterna hos streptokinas vid samtidig ultraljudsexponering av läkemedel och blodpropp samt förändringar i läkemedelseffekten när detta pre-exponeras med ultraljud. ·förändringar i de propplösande effekterna hos reteplase vid samtidig ultraljudsexponering av läkemedel och blodpropp samt förändringar i läkemedlets effekter efter pre-exponering av såväl läkemedel som blodpropp. ·beroendet av ultraljudsfrekvens, intensitet och pulstågslängd på sönderfalls-hastigheten hos Sonazoid® mikrobubblor. ·om långtidsexponering med ultraljud ger ökade skador på icke genomblödd hjärtmuskel. ·om långtidsexponering med ultraljud ger ökade skador på icke genomblödd hjärnvävnad. Metoder Ultraljudsförstärkt propplösande behandling För att utvärdera effekten av ultraljudsförstärkt blodproppslösande läkemedelsbehandling utvecklades en ny metod (I-II), där utvärdering gjordes genom att analysera utsöndringen av röda blodkroppar ur blodproppen. När ett blodkärl skadas ansamlas blodkroppar, bland annat röda blodkroppar, och det bildas en blodpropp. Blodkropparna binds samman av fibrintrådar på vilka de propplösande läkemedlen verkar. Blodproppar tillverkades genom att ta venöst blod från friska frivilliga försökspersoner. Efter detta tillsattes en vätska som tar bort kalcium ur blodet, för att blodet inte skulle koagulera. Blodet kunde sedan sparas i kylskåp upp till 8 dagar. Små blodproppar formades runt en garnstump genom att koagulationen återställdes efter återtillsättning av kalcium. De garninbäddade blodpropparna sänktes därefter ner i försöksbägare fyllda med koksaltlösning. Två blodproppar tillverkades samtidigt, den ena utsattes för behandling (blodproppslösande läkemedel, ultraljud eller en kombination av de båda) och den andra användes som kontroll (ingen behandling). När blodproppens fibrinnätverk löstes upp ökade antalet röda blodkropparna i koksaltlösningen. Under behandlingen togs därför en liten mängd av koksaltlösningen vid upprepade tillfälle, och koncentrationen av röda blodkroppar mättes i vätskan. Därefter jämfördes skillnaderna i utsöndring av röda blodkroppar mellan de behandlade blodpropparna och dess kontroller. Ultraljud med en frekvens av 1 MHz (1 miljon svängningar per sekund) pulsades genom att upprepande sända 100 pulser varje millisekund. Olika intensiteters effekt av denna ultraljudskombination på propplösningen utvärderades i kombination med läkemedel. Även försök där läkemedelslösningen pre-exponerades med ultraljud (utan någon blodpropp närvarande) utvärderades genom att först ultraljudsexponera läkemedlet under en timme, därefter tillsattes blodproppen i läkemedelslösningen. På detta sätt kunde mätningar göras för att utvärdera om ultraljudet förändrat läkemedlets egenskaper. Även blodproppar pre-exponerades med ultraljud innan de kom i kontakt med läkemedlet (reteplase). Detta för att utvärdera om ultraljudsexponeringen åstadkom förändringar i blodproppen som gav upphov till ökade effekter av det propplösande läkemedlet. Inledande försök med mikrobubblor har även utförts. Dessa försök var tänkta att ligga till grund för val av ultraljudsparametrar vid framtida propplösningsförsök med hjälp av mikrobubblor och ultraljud. Kartläggningen utfördes genom att utvärdera hur olika ultraljudskonfigurationer påverkade destruktionshastigheten hos mikrobubblorna. Mikrobubblorna som användes var Sonazoid® som är gjorda för att användas som kontrastmedel vid diagnostiskt ultraljud. Mikrobubblorna blandades i provrör där det ena provröret ultraljudsexponerades och det andra lämnades oexponerat. Mikrobubblorna har en diameter mellan 2,4 ? 3,5 µm, som något mindre än blodkroppar. Likheten i storlek med blodkroppar gjorde det möjligt att räkna antalet mikrobubblor i en maskin som normalt räknar blodkroppar. Beräkningar av destruktionshastigheten utfördes därefter vid olika tidsintervall av ultraljudsexponering. Potentiellt skadliga effekter av ultraljud Två olika metoder användes för att utvärdera om de ultraljudsparametrar som verkar positivt vid blodproppslösning kunde medföra ökade skador på vävnad som inte var cirkulerad. I det första försöket användes en grismodell (III) där man under öppen hjärtkirurgi stängde av blodflödet i ett av hjärtats blodkärl under en timme. När skadan uppstått, applicerades ultraljudet med intensitetsnivåer som visats fungera vid blodproppslösning. Ultraljudsexponeringen pågick under ytterligare en timme. Därefter togs hjärtat ut och små områden av hjärtmuskel togs där ultraljudet varit applicerat. Som kontrollmaterial togs hjärtmuskel från områden där inget ultraljud varit applicerat. Utvärdering av skadegraden utfördes i ultraljudsexponerad hjärtmuskel och jämfördes därefter med skadegraden hos oexponerad hjärtmuskel. Skadegraden i hjärtmuskelbitarna undersöktes med hjälp av mikroskop. I det andra försöket utvärderades effekterna av ultraljudsexponering på icke genomblödd hjärnvävnad hos råtta (IV). Cirkulationsstopp inducerades genom att placera en tunn nylontråd i ett av de kärl som försörjer hjärnan med blod. Därefter exponerades hjärnvävnaden för antingen ultraljud av tidigare nämnd effekt eller bara för ultraljudsgivaren. Detta medförde att hälften av råttorna exponerades för cirkulationsstopp och ultraljudsexponering och den andra hälften av råttorna utsattes endast för cirkulationsstopp. Efter 1,5 timmas cirkulationsstopp med eller utan ultraljudsexponering avlivades råttorna och hjärnorna togs ut. Därefter snittades hjärnorna i tolv 1 mm snitt och färgades in. Frisk hjärnvävnad färgades då röd och den skadade vävnaden lämnas ofärgad (vit). På detta sätt kunde jämförelse av storleken på de områden som skadats av cirkulationsstoppet uföras och jämföras med de områden som utsatts för både cirkulationsstopp och ultraljudsexponering. Resultat Ultraljudsexposition av streptokinas vid låga intensiteter (< 0,5 W/cm2) ökade effekten av läkemedlet när detta ultraljudsexponerades före eller tillsammans med blodproppen (31 respektive 33 %). Vid höga intensiteter (> 2 W/cm2) minskade effekten av läkemedlet (25 %) både då läkemedlet pre-exponerades med ultraljud och när blodproppen läkemedels- och ultraljudsexponerades samtidigt. I intensitetsområdet mellan höga och låga intensiteter kunde ingen förändring i läkemedelseffekten ses. Pre-exponering med ultraljud och exponering av blodproppen för reteplase och ultraljud samtidigt ökade effekterna av läkemedlet i det låga intensitetsområdet (0,125 W/cm2). De ökade effekterna av förbehandlingen försvann dock vid höga intensiteter, men kunde ses då blodproppen exponerades för reteplase och ultraljud samtidigt. Ökade effekter av reteplase såg även då blodproppen pre-exponerades med höga intensiteter (4 W/cm2) av ultraljud. Ultraljudsexponering åstadkom ingen minskning av reteplaseseffekten vid någon intensitet, dock fanns det intensitetsområden där ingen ökad effekt kunde sågs. Kartläggningen av Sonazoid® mikrobubblor visade att destruktionshastigheten var hög vid en ultraljudskonfiguration av låg frekvens och måttligt höga intensiteter, och att det fanns ett pulstågsberoende för att destruktionen skulle vara fortsatt hög. Vid högre frekvenser var destruktionshastigheten betydligt långsammare även vid höga intensiteter av ultraljud. Utvärderingen av eventuella oönskade effekter vid långtidsexponering med ultraljud på hjärtmuskel visade att ultraljudsexponeringen markant ökade skadorna i de områden som inte varit cirkulerade. Det fanns också skador efter ultraljudsexponering i områden som haft god cirkulation, dock är dessa resultat svårtolkade då det fanns en grundskada även i denna vävnad. Den ultraljudskonfiguration som visat vara skadlig vid exponering av hjärtmuskel gav inga ökade skador i försöken på icke-genomblödd hjärnvävnad hos råtta. Inga skador kunde heller ses på den hjärnvävnad som haft god cirkulation under ultraljudsexponeringen. Dock är detta en liten begränsad studie som bör anses som en pilotstudie. Slutsatser Resultaten från studierna i denna avhandling visar på vikten av att utvärdera både de goda effekterna och de oönskade effekterna av ultraljud då detta används för att förstärka propplösande behandling. Slutsatserna av de enskilda delarbetena är: ·att låga ultraljudsintensiteter ökar effekten av streptokinas. Dessa effekter sågs inom ett smalt intensitetsområde. Ökade effekter av läkemedlet kan uppnås genom pre-exponering av läkemedlet. Minskade effekter av streptokinase såg vid höga ultraljudsintensiteter. ·att ultraljudsexponering i kombination med reteplasebehandling ger upphov till två olika mekanismer, en där ultraljudet påverkar läkemedelsmolekylen, vilket medför ökade effekter, samt en där ultraljudet påverkar blodproppen så att strukturen förändras vilket också medför ökad effekt av läkemedlet. ·att ultraljudsexponering vid låga frekvenser ger snabb bubbeldestruktion, men vid högre frekvenser ses en långsammare destruktion. Minst 5 cyklers pulstågslängd krävs för snabb bubbeldestruktion. För fortsatt snabb bubbeldestruktion krävs en lägsta intensitet av 0.5 W/cm2. ·att ultraljudsnivåer som visats åstadkomma positiva effekter vid propplösande behandling ger ökade skador på icke genomblödd hjärtmuskel. ·att ultraljudsnivåer som visats åstadkomma positiva effekter vid propplösande behandling inte verkar ge ökad skadeutbredning på hjärnvävnad.