Molecular mechanisms of synaptic transmission and plasticity in spinal sensory pathways

Abstract: Popular Abstract in Swedish Det är normalt, och oftast inget man reflekterar över, att en vävnadsskada (exempelvis ett hudsår) är förknippad med förhöjd smärtkänslighet. Denna delas in i två fenomen: hyperalgesi, en förhöjd upplevelse av smärtsamma stimuli, och allodyni, som innebär att ett vanligtvis milt stimulus, exempelvis lätt beröring, upplevs som smärtsamt. Hyperalgesi och allodyni är normala fysiologiska responser som syftar till att underlätta skadeläkning, exempelvis genom att minimera användning av ett skadat hudområde, och försvinner i regel efter att skadan läkts. Ibland kan dock en förhöjd smärtkänslighet kvarstå en lång tid efter läkning, och därigenom övergå i kronisk smärta. I vissa fall kan sådana patologiska tillstånd uppkomma även i synbar avsaknad av vävnadsskada, till exempel i samband med en skada på en nerv, eller i fibromyalgi. Hyperalgesi och allodyni beror dels på perifer sensitisering, som innebär att smärtreceptorer i den skadade vävnaden förändras så att de lättare aktiveras av stimuli, och dels på central sensitisering, som involverar förändringar i ryggmärgen vilka leder till att en känselsignal ger upphov till ett starkare svar än normalt hos nervceller i ryggmärgen. Känselreceptorer utgör, eller är förbundna med, nervtrådar som går genom perifera nerver in till ryggmärgen. Varje nervtråd är ett utskott (axon) från en primär sensorisk nervcell. Dessa cellers cellkroppar finns utanför ryggmärgen, ansamlade i ganglier som passeras av nervtrådarna på väg in i ryggmärgen. I ryggmärgen bildar nervtrådarna kopplingar, synapser, med andra nervceller, vilka via synapserna tar emot känselsignalerna och förmedlar dem vidare, dels upp till hjärnan och dels ut i reflexbågar i ryggmärgen. Central sensitisering tros allmänt bero på en förstärkning av effektiviteten hos sådana s k primärafferenta (afferent i betydelsen inåtgående) synapser mellan primära sensoriska nervceller och nervceller i ryggmärgen. Förstärkning, eller försvagning, av synapser, synaptisk plasticitet, beror på molekylära förändringar i synapserna och är en viktig generell mekanism för inlärning och minne i hjärnan. Liknande mekanismer tros alltså ligga till grund för central sensitisering och hyperalgesi (och allodyni), men sådana molekylära förändringar i primärafferenta synapser har aldrig påvisats i samband med dessa fenomen. Syftet med de arbeten som ligger till grund för denna avhandling har varit dels att studera mekanismer för den normala signalöverföringen i primärafferenta synapser, och dels att försöka påvisa molekylära förändringar som relaterar till förstärkning av dessa synapser, i samband med en djurmodell för hyperalgesi. I dessa studier har vi framför allt utfört elektronmikroskopi på ryggmärgsvävnad från naiva (ej stimulerade) råttor och från sövda råttor i vilka hyperalgesi inducerats genom en hudinjektion av capsaicin (den substans i chilipeppar som ger en hettande känsla). Detta har kombinerats med injektion av en s k spårsubstans, som tas upp av nervtrådar i huden och transporteras genom dessa in till ryggmärgen, och med vars hjälp man kan identifiera synapser som får signaler från ett visst hudområde. För att detektera (?färga?) de substanser vi ville studera i ryggmärgsvävnaden, använde vi immunoguldteknik. Denna metod (och många liknande metoder) utnyttjar immunförsvarets förmåga att bilda antikroppar mot främmande ämnen, genom att man kan få immunceller (odlade eller i djur) att producera antikroppar som specifikt känner igen och binder en viss substans av intresse, t ex ett protein. I en immunoguldfärgning låter man antikroppar, specifika för substansen man är intresserad av, binda till substansen ifråga. Därefter låter man en sekundär antikropp binda till den första; denna sekundära antikropp är bunden till en guldpartikel, som har en diameter på exempelvis 10 nm (d v s en hundratusendels mm). Till skillnad från antikroppar, liksom organiska ämnen i allmänhet, är guldpartiklar väldigt elektrontäta, vilket innebär att då de utsätts för en elektronstråle (som i ett elektronmikroskop) studsar elektronerna i strålen bort från guldatomerna och sprids därmed i olika riktningar från dem. I mindre elektrontäta ämnen passerar elektronstrålen atomerna mer obehindrat. Genom att fokusera en sådan elektronstråle på en vävnad kan man med hög upplösning (i praktiken ca 100 gånger högre än i ett ljusmikroskop) detektera variationer i elektrontäthet i olika delar av vävnaden och på det sättet skapa en bild av vävnaden. I vävnad immunoguldfärgad för en viss substans syns guldpartiklarna som svarta runda korn. På det sättet kan man lokalisera, och bestämma mängden av, substansen i olika delar av vävnaden. Då en elektrisk signal når synapsen i den presynaptiska nervtråden frisätts från denna en signalsubstans, eller neurotransmittor, som genom diffusion sprids över till den postsynaptiska nervcellen. Där aktiverar signalsubstansen särskilda receptorproteiner som sitter i cellmembranet och ger upphov till en ny elektrisk signal. I primärafferenta synapser fungerar aminosyran glutamat som neurotransmittor, men det har spekulerats om den liknande aminosyran aspartat också har en roll som transmittor i dessa synapser, eftersom vissa receptorer som aktiveras av glutamat också kan aktiveras av aspartat. Detta skulle ha betydelse för synaptisk plasticitet, då just dessa receptorer är involverade i processer som leder till förstärkning av synapsen. Eftersom glutamat och aspartat har många funktioner i celler, t ex i energimetabolism och syntes av proteiner (som består av kedjor av aminosyror) är det dock svårt att avgöra om dessa aminosyror används som neurotransmittorer i en synaps. Vi visar i arbete I att aspartat endast förekommer i låga nivåer i primärafferenta synapser och inte associerat till vesiklar (membranblåsor), i vilka neurotransmittorer normalt lagras; detta tyder på att aspartat inte är en signalsubstans i dessa är synapser. I arbete II studerade vi ett protein, CaMKII, som visats vara viktigt för synaptisk plasticitet och inlärning i många andra delar av nervsystemet. Detta protein modifierar andra proteiner, t ex receptorer, genom att binda fosfat till (fosforylera) dem, och modulerar på så sätt dessa proteiners funktion. CaMKII, som normalt aktiveras i synapsen då synapsen aktiveras, kan också fosforylera sig själv, och förblir då aktivt även när synapsen är inaktiv. Denna unika egenskap har lett till spekulationer om att CaMKII skulle kunna vara involverat i stabilisering av styrkan hos en synaps som blivit förstärkt, och därigenom utgöra en ?minnesmolekyl?. Däremot är det inte känt om aktivt CaMKII även finns normalt i ?naiva? synapser som inte förstärkts, och därigenom kanske spelar en roll i normal synaptisk transmission. Med hjälp av immunoguldfärgningar av aktivt (fosforylerat) CaMKII kunde vi i arbete II visa att aktivt CaMKII fanns i nästan alla primärafferenta synapser i naiva, ostimulerade djur. Däremot fanns det avsevärt högre nivåer i synapser som förmedlar smärtsignaler än i sådana som aktiveras av beröring. Detta tyder på att aktivt CaMKII är involverat i normal synapsfunktion; olika nivåer av aktivt CaMKII skulle kunna indikera skillnader i synapsstyrka eller i förmåga till förstärkning. Nyligen har observationer publicerats som tyder på att CaMKII är involverad också i central sensitisering och hyperalgesi. I det tredje arbetet använde vi en modell för hyperalgesi för att studera eventuella förändringar i CaMKII i primärafferenta synapser. Som väntat observerade vi förändringar i två olika typer av smärtsynapser; förvånande nog skiljde de sig markant åt. I en typ (som förutom glutamat också frisätter vissa peptider, dvs korta aminosyrakedjor, och därför kallas peptiderg) ökade nivåerna av både CaMKII och aktivt CaMKII; i den andra, ickepeptiderga typen av smärtsynaps, minskade istället dessa nivåer. Vi har därmed påvisat molekylära förändringar i primärafferenta synapser i en djurmodell av hyperalgesi, men våra observationer tyder på en komplexare molekylär reglering av styrkan hos olika smärtsynapser i hyperalgesi än man tidigare trott. Styrkan hos en synaps beror bland annat på hur många receptorer som finns i membranet hos den postsynaptiska cellen. Det finns tämligen starka belägg från andra delar av nervsystemet för att aktivering av CaMKII i en synaps som använder glutamat kan leda till att antalet glutamatreceptorer i membranet ökar, och därmed till att synapsen förstärks. Därmed förväntade vi oss ett ökat antal glutamatreceptorer i peptiderga smärtsynapser i vår hyperalgesimodell, medan det var osäkert hur minskad aktivitet av CaMKII, som vi såg i ickepeptiderga smärtsynapser, skulle påverka antalet receptorer. I arbete IV observerade vi istället oförändrade nivåer av glutamatreceptorer i peptiderga smärtsynapser, men ökade nivåer i ickepeptiderga. Även om det är oklart hur dessa observationer skall tolkas, tyder de på att plasticitet i primärafferenta synapser, åtminstone i den djurmodell för hyperalgesi som vi studerat, inte är beroende av samma molekylära mekanismer som i andra glutamatsynapser.