Tissue kallikrein: pathophysiological role in acute pancreatitis

Abstract: Popular Abstract in Swedish Vävnadskallikrein (VK) är ett äggvitespjälkande protein som dels kan aktivera vävnadsnedbrytande enzymer som kollagenas och gelatinas och dels spjälkar kininogen till kininer (bradykinin och kallidin). Via bindning till speciella kininreceptorer (B2 receptorer) som finns överallt i kroppen, styr kininerna olika processer i de flesta av kroppens organ och vävnader såsom inflammation, kontroll av blodtryck och lokala blodflöden, kärlnybildning, socker och saltbalansen över cellmembran, sammandragningar av glatt muskulatur, ökad spermie rörlighet, bennedbrytning och cellnybildning. De inflammatoriska effekterna är kärlvidgning, ökad genomsläpplighet av kärlväggen, smärta, frisättning av olika substanser som styr den inflammatoriska reaktionen. Här kan nämnas cytokiner, platelet activating factor (PAF) och via aktivering av phospholipase A2 frisättning av prostatglandiner och leucotriener. VK bildas i nästan alla människans organ, utom levern. Allra mest bildas i salivkörtlarna, njurarna och i bukspottskörteln. Därav namnet kallikrein, som kommer av grekiskans Kallikreas, som betyder bukspottskörtel. Bukspottskörteln, pankreas, väger ca 70-100 g hos en vuxen människa och är belägen högt upp i buken bakom magsäcken. Körteln har två huvudsakliga funktioner, dels bildar den ett flertal hormoner som framför allt styr sockeromsättningen och dels bildar pankreas ett bikarbonatrikt sekret som neutraliserar den sura magsaften i tolvfingertarmen och som innehåller förstadier (proenzym) till ett flertal enzym verksamma i nedbrytningen av födans beståndsdelar. Dessa enzymer aktiveras, under normala betingelser, först när de utsöndrats till tolvfingertarmen. Akut inflammation i pankreas, s.k. akut pankreatit, drabbade 38/100 000 personer och år i Malmö under åren 1985-94. I de flesta fall läker sjukdomen utan några mer komplicerade behandlingsåtgärder eller kvarstående men. I cirka 20% av fallen, uppstår emellertid en svår akut pankreatit. Sjukdomsförloppet blir då komplicerat med långa vårdtider på intensivvårdsavdelning och eventuellt behov av upprepade operationer. Dödligheten vid svår akut pankreatit är omkring 20%, och de som överlever riskerar livslånga men i form av insulinkrävande sockersjuka och/eller matspjälkningsproblem med problem att tillgodogöra sig födan, kronisk buksmärta och diarré. De två dominerande orsakerna till akut pankreatit är passage av gallstenar från gallblåsan, via gallgången förbi pankreasgången, samt flitig alkoholkonsumtion. Tillsammans svarar alkohol och gallsten för ca 70% av fallen. Diverse andra orsaker är beskrivna, men i ca 20% av fallen kan inte någon säker orsak påvisas. Sättet på vilket de olika agens leder till akut pankreatit är ej helt klarlagt. Vid gallstensutlöst akut pankreatit är backflöde av galla upp i pankreasgången och hinder för pankreas sekretutsöndring orsakat av en blockerande gallsten de dominerande hypoteserna. Vid alkoholutlöst akut pankreatit är mekanismen sannolikt en direkt skadlig påverkan på pankreas sekretbildande celler i kombination med en stimulering av körteln orsakad av alkohol och eventuellt accentuerat av ett samtidigt nikotinintag. Oberoende av agens kan olika svårighetsgrader ses. Trypsinogen är det dominerande proenzymet, och detta aktiveras till trypsin, som i sin tur kan aktivera övriga proenzym, inklusive VK. Om de skyddsproteiner, som normalt finns i pankreas och i blodet, inte kan hämma de aktiverade vävnadsnedbrytande pankreasenzymerna skadas pankreaskörteln och inflammation utvecklas. Flertalet andra inflammationsbefrämjande faktorer deltager i processen, t. ex. vita blodkroppar, fria syreradikaler, kininer och andra inflammatoriska reglersystem s.k. mediatorer. Inflammationen leder till kärlvidgning och ödem, samt skada på småkärl med blodproppar och blödningar i pankreas som följd. Detta leder till en nedsatt blodcirkulation i pankreaskörteln och vävnadsdöd, vilket aggraverar inflammationen ytterliggare. Inflammationen riskerar, i svårare fall, att engagera även andra organ, s.k. systemisk inflammation, via de inflammatoriska mediatorerna och de vita blodkropparna. Nedsatt blodcirkulation av tarmarna leder till nedsatt tarmrörlighet, försämrad skyddsfunktion i tarmväggen och överväxt av bakterier i tarmen. Bakterier kan då vandra från tarmen in i blod och lymfa. Detta kan leda till lokala komplikationer såsom infektion av död pankreasvävnad och varhärdar, samt generella infektioner såsom lunginflammation och allmän blodförgiftning. Frisättning av kininer har påvisats vid akut pankreatit och kininernas inflammatoriska effekter stämmer väl med det inflammatoriska svar man ser vid akut pankreatit. De senaste åren har specifika kininreceptor blockerare utvecklats och detta innebär en ny potentiell behandlingsmöjlighet vid akut pankreatit. Experimentella studier med dessa kininreceptor blockerare, har konfirmerat kininernas viktiga roll i sjukdomsprocessen vid akut pankreatit. Kininer kan bildas av flera olika enzymer; dels av i blodet cirkulerande kallikrein, dels av enzymer frisatta av vita blodkroppar och dels av trypsin och VK. Trypsinets roll vid akut pankreatit har blivit utförligt studerat, emedan VK:s roll hitintills varit mindre klarlagd. Pankreaskörteln innehåller stora mängder VK och syftet med detta arbete har varit att klargöra VK:s roll vid akut pankreatit. SYFTE, METODER OCH RESULTAT Syftet med delarbete I var att studera frisättningen och omsättningen av VK vid experimentell akut pankreatit hos sövd gris. Akut pankreatit utlöstes hos tolv grisar medelst injektion av galla (Grupp A, n = 6) eller en blandning av galla och trypsin (Grupp B, n = 6) i pankreasgången. Djuren hölls sövda under hela försöket. Frisatt VK mättes med en metod som utarbetades av oss (radioimmunoassay = RIA) och vävnadskallikreinets samspel med skyddsproteinerna i blod och bukvätska studerades. Normalvärdet av vävnadskallikrein i grisplasma och normal bukvätska fastställdes till 2.17 microgram 0.11 respektive 1.91 microgram 0.19 microgram/l (SEM) (n=28). Bukspott innehöll 1.3 mg/l och urin 123 microgram/l (n=2). Den experimentella akuta pankreatiten gav upphov till en generell svullnad och områden med växlande grader av vävnadsdöd i pankreas. Utgången var dödlig inom 24 timmar hos alla utom en gris i Grupp A. Nivån av vävnadskallikrein i blod steg snabbt, följt av en långsam stegring till ca 1,5 gånger normalvärdet. Vi fann en kraftig frisättning av VK till bukvätskan hos alla grisarna (200 respektive 2000 gånger normalvärdet, i Grupp A respektive B). VK i bukvätskan var bundet till alfa1alfa2-macroglobulin och alfa1-proteinase inhibitor, men en stor andel var också obundet och enzymatiskt aktivt. Vår tolkning blir att frisättning av VK sker i stor utsträckning, framför allt till bukvätskan, och kan spela en betydande roll vid kininaktivering vid akut pankreatit. I delarbete II undersöktes VK:s interaktioner med skyddsproteinerna i blodet hos gris, dels i heldjursförsök (in vivo) och dels i provrör (in vitro). Olika reaktionsblandningar innehållande radioaktivt märkt och/eller omärkt VK och blodplasma, inkuberades under olika tidsrymder. Radioaktivt märkt VK sprutades in i blodbanan på fyra stycken grisar. Fördelningen av VK:s bindning till skyddsproteinerna i plasma och tidsförloppet för dessa bindningar, samt skyddsproteinernas förmåga att förhindra kininbildning av VK undersöktes sedan. Eliminationen av VK under fem timmar efter injektionen beräknades och upptaget i respektive grisorgan mättes. I grisplasma föreföll alfa1alfa2-macroglobulin vara de huvudsakliga skyddsproteinen mot VK. En mindre fraktion av VK band sig till alfa1-proteinase inhibitor. Hämningen av VK skedde långsamt (tog flera minuter) och även om skyddsproteinerna i grisplasma kunde binda mer VK ju längre tid som förlöpte, föreföll det som om skyddsproteinerna inte kunde erbjuda ett effektivt skydd mot VK:s enzymatiska aktivitet. Insprutade VK försvann från blodbanan med en initial snabb fas (T1/2 = 10 min.) representerande utspädning och omhändertagande av majoriteten av insprutat VK, följt av en långsammare fas (T1/2 = 100 min.) där resterande insprutat VK eliminerades. VK bundet till skyddsprotein elimineras via levern. Eftersom levern också kan eliminera obundet VK, bedömdes levern utgöra det huvudsakliga organet för elimination av VK från blodet hos gris. En mindre del av insprutat VK kunde passera ut via njurarna till urinen. I delarbete III studerades frisättningen och omsättningen av VK, och dess samspel med skyddsproteinerna i blod och en specifik VK-hämmare, aprotinin, vid svår akut pankreatit hos människa. Fyrtioåtta patienter med svår akut pankreatit, behandlades med buksköljningar antingen med koksalt (Kontrollgrupp, n = 26) eller med koksalt + aprotinin (Aprotiningrupp, n = 22). En metod (RIA) för att mäta humant VK utvecklades och denna användes för att mäta nivåerna i bukvätskan och buksköljvätskan hos patienterna. En annan metod (ELISA) för att mäta en specifik VK-hämmare, kallistatin utarbetades också och kallistatinnivåerna i blod, bukvätska och buksköljningar mättes. VK:s samspel med aprotinin, kallistatin och de övriga skyddsproteinerna i plasma och bukvätska studerades. VK:s samspel med aprotinin och skyddsproteinerna i blod studerades in vitro. Normalvärdet i plasma för kallistatin var 20.6 mg/l (range 15.9 - 26.7) (n = 25). Bukspott och urin innehöll 0.76 mg/l respektive 89 microgram/l VK (n = 1). Stora mängder VK frisattes till bukvätskan vid akut pankreatit, men inget obundet vävnadskallikrein kunde påvisas. Buksköljningarna minskade effektivt mängden frisatt VK ifrån bukhålan. Frisatt VK bands både i blodet och i bukvätskan till kallistatin och i aprotiningruppen även till aprotinin. Sänkta plasmanivåer av kallistatin (cirka 50%) förelåg hos patienterna redan vid ankomsten, och kallistatinnivåerna i plasma fortsatte vara sänkta under hela den första veckan. Kallistatinnivån i bukvätskan minskade i buksköljvätskorna, vilket vi tolkar som både en utsköljningseffekt, men också betingat av en konsumtion av hämmaren. Behandlingen med aprotinin i buksköljvätskan resulterade i en signifikant skillnad så till vida att sex patienter i kontrollgruppen behövde opereras p.g.a. vävnadsdöd i pankreas jämfört med ingen i aprotiningruppen. Dessa sex opererade patienter hade en signifikant sänkning av kallistatin i både bukvätska och blod jämfört med övriga patienter. Denna skillnad sågs redan vid dessa patienters ankomst till sjukhuset, varför kallistatin kanske kan användas som en tidig markör för svårighetsgrad alternativt pankreasvävnadsdöd vid akut pankreatit. I delarbete IV studerades metabolismen av radioaktivt märkt VK insprutat dels i tolvfingertarmen och dels direkt i blodet. Till de försöken med insprutning till blodet (n = 2) användes VK som hade renats fram ifrån mänsklig urin. Kommersiellt VK användes för insprutning i tolvfingertarmen (n = 1). Eliminationen av VK från blodbanan beräknades, ett eventuellt upptag av VK ifrån tarmen studerades och utsöndringen av radioaktiviteten i urin och avföring under 72 timmar efter insprutning mättes. I provrör undersöktes effekten av inkubering av VK med magsaft och tolvfingertarmsvätska. Cirka 1 mg VK renades ifrån 85 liter urin. VK miste omedelbart sin enzymatiska aktivitet efter kontakt med den sura magsaften, emedan det var stabilt i tolvfingertarmsvätska. Inget upptag av vävnadskallikrein ifrån tarmen kunde registreras. VK eliminerades från blodet med ett bifasiskt förlopp, med en initial snabb fas (T1/2 = 9 min.) representerande utspädning och elimination av majoriteten av insprutat VK, följt av en långsammare fas (T1/2 = 20 timmar.) där resterande insprutat VK eliminerades. VK bands fort till ett skyddsprotein i plasma, med en molekylvikt på 50 – 70 kDa. Detta skyddsprotein tolkar vi som kallistatin alternativt protein C inhibitor. En liten fraktion av insprutat VK var obundet, även 15 minuter efter insprutningen, och detta VK kan ha olika fysiologiska effekter. VK bundet till skyddsprotein elimineras via levern, som också kan eliminera obundet VK. Obundet VK eliminerades dessutom ifrån plasma, åtminstone delvis, via njurarna. KONKLUSIONER Sammanfattningsvis visar våra resultat: - att stora mängder VK frisättes ifrån pankreas vid akut pankreatit, - att detta frisatta VK kan spela en betydande roll vid den lokala kininfrisättningen och inflammationen vid akut pankreatit, - att gris saknar den specifika VK-hämmaren kallistatin och de dominerande skyddsproteinerna mot VK hos gris är alfa1alfa2-macroglobulin, - att frisatt VK vid akut pankreatit hos människa binds till kallistatin både i bukvätskan och i blodet, - att vävnadskallikrein i urinen delvis har sitt ursprung från blodet, - att det inte är troligt att oralt tillfört vävnadskallikrein tages upp av kroppen ifrån tarmen.