Phagocytosis by neutrophils - studies on phagosome dynamics and membrane traffic modulation by Streptococcus pyogenes

Abstract: Popular Abstract in Swedish Hur lurar mördarbakterier våra celler? Neutrofiler och fagocytos räddar liv Utan vårt immunförsvar så skulle vi snabbt dö i infektioner från mikroorganismer. Det består ett komplicerat system av celler och molekyler som tillsammans kan klara av att stå emot attacker från bakterier, virus, svampar eller parasiter. Cellerna i immunförsvaret utgörs av vita blodkroppar och den sort som det finns flest av är neutrofilen. Neutrofilen är en av våra ätarceller och har som sin främsta uppgift att snabbt leta reda på farliga organismer, som t ex sjukdomsalstrande bakterier och sen döda dem genom att äta upp dem. Denna process kallas fagocytos och inleds med att molekyler på neutrofilens yta känner igen molekyler på bakteriens yta. Detta utlöser en signaleringskaskad inuti neutrofilen som tills slut leder till att delar av cellmembranet omsluter bakterien och knoppas av som en blåsa inåt i cellen; då har en fagosom bildats. Till fagosomen skickas därefter en stor mängd farliga substanser för att döda bakterien och bryta ner den. Det praktiska med en membranblåsa som fagosomen är att det som är farligt hålls isolerat för att inte skada neutrofilen och omgivningen. I de allra flesta fall dödas bakterier snabbt och effektivt av våra neutrofiler, men det finns undantag. Streptokocker kan lura neutrofiler Grupp A streptokocker, eller på latin Streptoccus pyogenes, är en våra vanligaste sjukdomsalstrande bakterier och orsakar många sjukdomar, däribland halsfluss, scharlakansfeber och rosfeber. De kan också orsaka väldigt allvarliga tillstånd som STSS (streptococcal toxic shock syndrome) och nekrotiserande fasciit. Det sistnämnda är anledningen till att kvällstidningarna ofta benämner dessa bakterier för “mördarbakterier” eller “köttätande bakterier”. Under de senaste åren har det visat sig att dessa bakterier har mekanismer för att kunna överleva fagocytos av neutrofiler. Eftersom neutrofilerna ofta är först på plats och äter upp bakterierna, så innebär det att streptokockerna är skyddade från ytterliggare angrepp av immunförsvaret så länge de kan klara sig i neutrofilerna. Min avhandling handlar om att på molekylär nivå karakterisera hur S. pyogenes kan klara av att bli uppätna av våra neutrofiler. Mycket av min doktorandtid har handlat om att utveckla metoder för att kunna studera detta, vilket har lett till Arbete 1 och Arbete 2. De två återstående arbetena beskriver nya fynd om hur neutrofilen fungerar under fagocytos (Arbete 3) och hur streptokocker kan påverka neutrofilen efter att ha blivit uppätna (Arbete 4). Dessa arbeten sammanfattas nedan. Verktyg 1 – Använda cancerceller och cancerbehandling för att studera neutrofiler I Arbete 1 har vi visat att leukemi-celler kan användas som modell-system för att studera fagocytos av S. pyogenes. Cancerceller kan under rätt betingelser leva hur länge som helst genom att de delar sig hela tiden. Det är också det som är problemet med sådana celler i människor och som behandling finns det ibland medel som kan hindra dem från att dela sig. Vi har använt oss av leukemi-celler (HL-60) härstammande från en kvinna på sjuttiotalet och gett dessa en sådan celldelningshämmande substans, som är en variant av A-vitamin. Det som händer då är att de omogna HL-60 cellerna börjar mogna och bli mer och mer lika neutrofiler och därmed kan användas för att studera fagocytos. Verktyg 2 – Skapa magnetiska bakterier för att isolera fagosomer Det är en stor fördel att kunna analysera enbart fagosomer och på så sätt få reda på vilka ämnen som samlas eller försvinner under tiden en bakterie befinner sig där. För att kunna göra detta med bakterier visade det sig att det behövdes nya verktyg och den största delen av min doktorandtid har bestått av att utveckla en ny metod för att isolera fagosomer. I Arbete 2 har vi visat att det går att fästa in nanometer-stora magnetiska partiklar på ytan av bakterier. Med hjälp av detta har vi sedan lyckats med att magnetiskt rena fram intakta bakterie-innehållande fagosomer från neutrofiler. Detta kommer troligtvis att vara till stor glädje för forskningsfältet och har redan lett till ökad förståelse kring hur fagocytos-processen fungerar i neutrofiler (se nedan). Fynd 1 – Nya mekanismer för leverans av anti-bakteriella substanser till fagosomer När en neutrofil äter en bakterie och börjar skapa en fagosom så startar direkt en väldigt omfattande förflyttning av andra membranblåsor (vesiklar och granula) som innehåller bl a bakteriedödande ämnen. När dessa granula smälter samman med fagosomen möjliggör det att neutrofiler kan döda och bryta ner bakterier. De mekanismer som styr sådan leverans till cellytan (tidig fas) har i många fall antagits vara de samma som de till fagosomen (sen fas). I Arbete 3 har vi genom att bl a använda vår metod för att isolera fagosomer funnit att leverans av granula-innehåll skiljer sig åt om man jämför tidig och sen fas. Vi har visat att detta regleras av olika mekanismer där leverans under den tidiga fasen är beroende av kalcium och vissa membranstrukturer; leverans till fagosomen är däremot oberoende av dessa faktorer. Fynd 2 – Streptokocker stör pH-mekanismer i fagosomen efter att ha blivit uppätna av neutrofiler Koncentrationen av vätejoner, dvs pH, är centralt för hur en fagosom fungerar. Det är väldigt svårt att studera, då man inte kan fixera vätejoner och de snabbt diffunderar i vätskor. För att undersöka hur det ser ut i bakterie-innehållande fagosomer så har jag i Arbete 4 använt mig av avancerad digital mikroskopi. Intensiteten på ljuset från vissa fluorescenta molekyler varierar med pH. Genom att fästa sådana till bakterieytan och sedan fånga det fluorescerande ljuset med en digital kamera går det med bildanalys att omvandla ljusintensiteten till pH-värden. Med hjälp av ett specialutrustat mikroskop går detta att göra på neutrofiler som håller på att äta bakterier och därmed mäta pH direkt i fagosomen. På detta sätt har jag kunnat visa att S. pyogenes hämmar inflödet av vätejoner i fagosomen (och därmed håller pH högt) genom att förhindra leveransen av vätejons-pumpar.