Characterization of the perturbed differentiation in neuroblastoma, aided by the analysis of normal sympathetic nervous system development

Abstract: Popular Abstract in Swedish POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING PÅ SVENSKA Neuroblastom är en barntumör i nervsystemet som drabbar ungefär 14 barn i Sverige varje år. Neuroblastom uppstår under bildandet av det sympatiska nervsystemet, som är den del av nervsystemet som ansvarar för vår reaktion på fara och stress. Det sympatiska nervsystemet bildas under fosterutvecklingen och de första åren efter födseln. Barn som drabbas av neuroblastom brukar därför vara under 7 år. En teori om hur neuroblastom uppstår är att nervcellerna inte mognar (differentierar ) som de ska, utan istället blockeras/fastnar cellerna i ett omoget stadium och behåller sin förmåga att dela sig. Cancer uppstår när en cell delar sig okontrollerbart utan att svara på kroppens signaler om celldelningsstopp. Ett problem med neuroblastom är att det är en mycket heterogen sjukdom vilket gör det svårt att ge en tillförlitlig prognos, och svårt att avgöra vilken typ av behandling som ska användas på varje enskild patient. Vissa barn överlever inte sin sjukdom trots god prognos eller intensiv behandling. I andra fall kan tumörer till och med tillbakabildas spontant. Viktiga faktorer som påverkar sjukdomsprognos är patientens ålder vid diagnos (barn yngre än 18 månader har bättre prognos), tumörens lokalisering i kroppen, och hur mycket tumören har metastaserat. Denna avhandling har tre huvudmål: 1) att studera biologin bakom den defekta nervcellsutmognad som har skett i neuroblastomtumörer 2) att försöka dela in neuroblastomtumörer i mer homogena undergrupper baserat på tumörcellernas utseende 3) att hitta en biologisk förklaring till att neuroblastomtumörer beter sig så olika åt från fall till fall. Eftersom neuroblastom uppstår som ett resultat av defekter i bildandet av det sympatiska nervsystemet har vi studerat gener som styr den normala nervcellsutvecklingen under fostertiden. Utvecklingen från en enda befruktad äggcell till en hel människa, med omkring 10 000 000 000 000 celler som har differentierat till olika specialiteter, styrs av gener som aktiveras och stängs av under strikt kontroll. Vissa gener är nervcellsspecifika, och finns bara i nervceller, medan andra gener är unika för t ex muskelceller. Ett stort antal gener är dock gemensamma för alla celler i kroppen. Neurotrofiner är ämnen som styr nervcellsdifferentiering. Den viktigaste neurotrofinen för sympatiska nervcellers utmognad är NGF (nerve growth factor). En frisk cell svarar på NGF signalering via en receptor, som heter Trk A, och som sitter på cellytan. Odlade neuroblastomceller från högmaligna tumörer uttrycker Trk A-receptorn men svarar ändå inte på NGF. I delarbete I har vi därför stoppat in Trk A-genen från en frisk nervcell i neuroblastomceller. Som en följd av detta svarar neuroblastomcellerna på NGF och differentierar. En förklaring till detta resultat kan vara att en defekt TrkA-gen är en av orsakerna till misslyckad nervcellsutmognad i neuroblastom. Det sympatiska nervsystemet hos människa består av fem olika sorters nervceller, som skiljer sig åt i funktion och lokalisering. Under fosterutvecklingen, innan cellerna är färdigutvecklade, är det svårt att skilja på dessa celltyper enbart med hjälp av utseendet. I arbete II, III och IV i denna avhandling har vi därför karaktäriserat dessa fem celltyper med avseende på deras aktivitet av olika gener. Vi har letat efter markörgener, som är specifikt aktiva i olika celler och som vi sedan kan använda för att särskilja de fem celltyperna. Man kan dela upp dessa fem celltyper i två huvudgrupper, nämligen neuronala och neuroendokrina celler. Karaktäriseringen visade att markörgenerna Bcl-2, HNK-1, GAP-43 och NPY är specifikt aktiva i de neuronala cellerna, medan chromogranin A/B och IGF-2 är specifika för de neuroendokrina cellerna. När vi sedan studerar neuroblastomtumörers aktivitet av samma markörgener visar det sig att en stor del av de tumörer som har god prognos, och där tumörerna inte är så kliniskt aggressiva, uttrycker markörgenerna chromogranin A/B och IGF-2. Alltså verkar det som om dessa tumörer har utvecklats åt ett neuroendokrint håll. Vidare uppvisar dessa tumörer ett speciellt mönster där cancercellerna växer i cirklar. Vi har kallat denna struktur för lobul och sådana tumörer för lobultumörer. Det är bara cellerna i ytterkanten av lobulen som delar sig medan cellerna i mitten har slutat dela sig och i stället aktiverar de neuroendokrina markörgenerna. Till skillnad från lobultumörerna aktiverar de högmaligna tumörerna bara markörgener för omogna neuronala celler och inga gener som tyder på neuroendokrin utmognad. Baserat på dessa resultat verkar det alltså som om neuroblastomtumörer skulle kunna utgå från flera olika celltyper i det sympatiska nervsystemet. De högmaligna tumörerna utgår från de neuronala cellerna och lobultumörerna från de neuroendokrina. I delarbete III har vi studerat lobultumörerna närmare och visat att i lobultumörer finns förutom de neuroendokrina generna (som alltså är aktiva mot mitten i lobulen) också en aktivitet av neuronspecifika gener. Till en början verkade detta paradoxalt, men det visade sig att dessa gener är aktiva i olika cell-lager i tumören. De neuronala generna är aktiva i de celler i ytterkanten av lobulen som fortfarande delar sig. Ju längre in mot lobulmitten man analyserar tumörcellerna så avtar cellernas aktivitet av neuronala gener och istället aktiveras de neuroendokrina generna. Slutsatsen är att cellerna spontant byter cellspecificitet eller cellspecialitet i dessa lobultumörer. I delarbete IV har vi studerat neuroblastomatumörers uttryck av två gener som normalt bara är aktiva under fosterutvecklingen, och som alltså inte finns i det sympatiska nervsystemet efter födseln. Vi såg att den ena genen, HASH-1, normalt bara är aktiv fram till fostervecka 7. Ändå är denna gen aktiv i vissa neuroblastomtumörer. Detta kan betyda att dessa tumörer faktiskt uppstår så tidigt under fosterutvecklingen. En alternativ förklaring är att tumörceller tillbakabildas så att de liknar omogna nervceller. Den andra genen, dHAND, som normalt inte heller är aktiv efter födseln hittar vi i de flesta tumörer vi har undersökt. Kanske är det så att denna gen måste inaktiveras för att en nervcell ska kunna differentiera fullt ut. I delarbete V och VI har vi analyserat neuroblastomtumörer med avseende på deras uttryck av gener som kontrollerar celldelning och celldöd. En frisk cell som inte längre behövs begår självmord (detta kallas apoptos). Analysen visade att lobultumörerna, som alltså oftast hittas hos patienter med god prognos, har fler apoptotiska celler än högmaligna tumörer. Gener som aktiverar celldöd är uttryckta i lobultumörerna ju längre in mot mitten man analyserar och precis i mitten av lobulen hittar man rester av celler som dött genom apoptos. Att cellerna har kvar sin naturliga förmåga att dö av apoptos när någonting är fel, kan vara en anledning till att lågmaligna tumörer inte är så aggressiva. En sidoeffekt av denna studie var att vi fann en biologisk förklaring till ett tidigare oförklarat diagnostiskt begrepp, nämligen mitosis-karyorrhexis index (antalet celler med avvikande utseende). Patologer använder sig av detta index när de diagnostiserar och sätter prognos på neuroblastompreparat. Ju högre mitosis-karyorrhexis index en tumör har, desto sämre prognos. I delarbete VI visar vi att celler som klassificerats som karyorrhektiska (dvs har ett avvikande utseende) i själva verket antingen delar sig eller begår självmord. Eftersom riklig celldelning i tumören korrelerar till dålig prognos, och hög frekvens apoptos är kopplat till god prognos, är det relevant att känna till beståndsdelarna i detta index.