Development of low affinity techniques for applications in clinical chemistry

Abstract: Popular Abstract in Swedish I vår kropp pågår ständigt interaktioner mellan olika molekyler. Det är dessa interaktioner som styr hur vi mår och vad som händer i kroppen. Många av dessa interaktioner är svaga, vilket gör att det krävs många sådana interaktioner samtidigt för att uppnå effekt. Svaga interaktioner är snabba och reversibla, vilket betyder att kroppen snabbt kan anpassa sig efter nya förhållanden. Syftet med denna avhandling har varit att försöka uttnyttja sådana svaga interaktioner inom klinisk kemi för att utveckla analysmetoder som underlättar för läkare att ställa rätt diagnos. En metod som utnyttjar svaga bindningar mellan molekyler är svagaffinitets-kromatografi (weak affinity chromatography, WAC). Den går ut på att man kopplar upp ett ämne (en ligand) på kulor eller partiklar som sedan packas i en kolonn. Därefter låter man en blandning av molekyler som binder till liganden passera genom kolonnen. Dessa molekyler kommer sedan ut ur kolonnen separerade från varandra med den molekyl som binder hårdast till kolonnen sist. För att lära känna metoden har två olika grupper av proteiner studerats - lektiner och antikroppar. Lektiner är proteiner som binder specifikt till vissa sockerstrukturer. I delarbete I har ett lektin som finns i vetegroddar, WGA (wheat germ agglutinin), kopplats upp på en kolonn. Denna kolonn har sedan använts för att separera olika sockermolekyler. Bindningsstyrkorna mellan dessa socker och WGA har bestämts och hör till de lägsta som hittills använts för en lyckad separation. En WGA-kolonn har också använts i delarbete II för att mäta aktiviteten hos ett enzym (ett protein med katalytisk förmåga) som katalyserar överföringen av en sockerenhet från ett socker till ett annat. De båda sockren binder olika hårt till WGA och separeras därmed på kolonnen. Genom att analysera prover på kolonnen vid olika tidpunkter kan man följa ökningen av slutprodukten. Antikroppar är en grupp proteiner som finns i blodet och har till uppgift att känna igen och binda till kroppsfrämmande substanser (antigen). De är en viktig del av vårt immunförsvar, och att en antikropp binder till t.ex. en bakterie leder till att bakterien oskadliggörs. Antikroppar finns med allt från mycket svag bindningsstyrka till väldigt stark (i princip irreversibel) inbindning och kan också utnyttjas i affinitetskromatografi. Traditionellt har man varit mest intresserad av de antikroppar som binder starkt till sitt antigen, vilket betyder att de urvalsmetoder som finns vid framtagning av antikroppar förbiser de antikroppar som har en svag bindning till resp. antigen. Detta diskuteras i arbete III, där utvecklingen av en urvalsmetod baserad på WAC beskrivs. I arbete IV studeras WAC teoretiskt och genom att lösa de kromatografiska ekvationerna m.h.a. av ett datorprogram kan olika parametrars betydelse studeras. Här visas också att affinitet (bindningsstyrka) och bindningshastighet kan bestämmas m.h.a. WAC. Ett område inom klinisk kemi som det forskats mycket om är diagnos av akut hjärtinfarkt (acute myocardial infarction, AMI). För att få så bra resultat som möjligt vid behandling är det viktigt att börja behandlingen så snabbt som möjligt. Därför är det viktigt att kunna ställa rätt diagnos snabbt. Bröstsmärta tillsammans med EKG-förändringar är det man går efter i första hand, men när EKG-resultaten är oklara blir de biokemiska förändringarna i blodet avgörande. Många olika ämnen har testats som markörer för hjärtinfarkt. Ett sådant ämne är kreatinkinas MB (CKMB). En ökad halt av CKMB har länge använts vid diagnos av AMI. CKMB finns i två subformer - en vävnadsform, CKMB2, och en serumform, CKMB1. När CKMB2 kommer ut i blodet klyvs en aminosyra (byggsten i ett protein) av och CKMB1 har bildats. Genom att mäta förhållandet mellan CKMB2 och CKMB1 har man en tidigare markör för AMI, eftersom detta förhållande ökar över normal nivå innan totalmängden CKMB kommit över referensintervallet. I arbete V har antikroppar som skiljer mellan CKMB2 och CKMB1 tagits fram och analyserats. Dessa antikroppar kommer förhoppningsvis att kunna användas i en metod för CKMB2/CKMB1-analys och därmed en snabbare diagnos av AMI i framtiden.