Bioprocess Monitoring and Control in Pseudomonas cepacia and recombinant Escherichia coli cultivations

Abstract: Popular Abstract in Swedish Bioprocesser är samlingsnamnet på alla de system där man utnyttjar någon biologiskt aktiv komponent (biokatalysator) för att utföra (katalysera) en bestämd reaktion. I den här avhandlingen används ordet bioprocess för mikrobiologiska odlingsprocesser, och biokatalysatorn är då en mikroorganism. Man kan utnyttja mikroorganismer för att producera t.ex. enzymer (för miljövänlig pappersblekning, i tvättmedel), läkemedel (insulin, tillväxthormon), "sig själva" (bagerijäst) mm. Det finns olika typer av mikroorganismer som man kan använda och här har vi koncentrerat oss på bakterier. Vilken organism man väljer beror naturligtvis på vad man vill producera. De senare årens utveckling av genteknik har emellertid gjort att man väldigt ofta använder Escherichia coli. E. coli finns naturligt i tarmkanalen hos människor och djur, men de typer som man använder på ett laboratorium skiljer sig ganska mycket från den naturliga vildtypen. Med hjälp av gentekniska metoder kan man få E. coli att producera stora mängder av protein som egentligen hör hemma hos andra mikroorganismer (de två protein som studerats här) eller tom små enkla humana (mänskliga) protein (insulin, tillväxthormon). Dessa proteiner kallas rekombinanta proteiner. Det fungerar inte så bra att låta E. coli producera stora, komplicerade proteiner från högre organismer som djur och växter, bla. eftersom dessa ofta är glykosylerade (det finns sockergrupper kopplade på proteinet). Glykosyleringsmönstret är ofta viktigt för proteinets funktion och för sådana produkter får man välja någon annan typ av mikroorganism (t.ex. bagerijäst), insektsceller eller djurceller. Trots att en bakteriecell är så liten (en E. coli cell är ungefär en tusendels mm lång ) så sker det flera tusen olika reaktioner inne i cellen när den växer och förökar sig. När man odlar bakterier i syftet att producera rekombinanta proteiner ställer man till oreda bland dessa reaktioner eftersom man tvingar cellen att utnyttja dem på ett sätt som den egentligen inte skall göra. En viktig del i mikrobiell odlingsteknik är att försöka förstå och på något sätt mäta vad som händer inne i cellen. Innehållet i en bioreaktor består av metaboliskt aktiva (levande) celler i en vattenlösning med alla de näringsämnen som behövs för att bakterierna skall föröka sig och producera det man önskar. Dessutom blåser man luft in i vätskan för att bakterierna skall kunna respirera (andas) och rör om ordentligt för att skapa en homogen miljö. För att allting skall fungera bra måste innehållet i bioreaktorn hela tiden anpassas efter bakteriernas behov. Man måste se till att ha rätt temperatur, att det finns tillräckligt med näring och syre och att pH-värdet är rätt. Allt detta förändras efterhand som bakterierna förökar sig och därför måste man kompensera för dessa förändringar. Till det använder man kontroll och övervakningssystem som automatiskt ser till att t.ex. kyla när temperaturen stiger. Om man skall lyckas med sin odling och för att alltid uppnå samma resultat så är dessa styr- och övervakningssystem mycket viktiga. Avsikten med det här arbetet har bla.varit att hitta nya mätmetoder för att bättre kunna förstå vad som händer under en odling. Dessa mätmetoder kan också användas för att styra processen, dvs att få bakterierna att göra det vi vill att de ska göra. Det finns ett välkänt problem då man odlar E. coli på glukos. Cellerna behöver glukosen för att kunna bygga ny cellmassa och för att få energi till detta. Om man doserar för mycket, klarar cellerna inte av att ta hand om glukosen på rätt sätt utan bildar ättiksyra istället. Ättiksyran påverkar cellerna negativt - de slutar växa och slutar att producera det rekombinanta proteinet. Det är därför viktigt att kunna mäta ättiksyrahalten i bioreaktorn. I detta arbete finns två metoder beskrivna som möjliggör detta. Det finns också beskrivet hur man doserar glukosen på rätt sätt, dvs att man hela tiden tillför precis lagom mycket. Att dosera rätt mängd näringsämne har varit även varit viktigt i ett arbete där vi har odlat en annan bakterie, Pseudomonas cepacia. Denna bakterie kan växa på en rad olika substanser, bla. på många giftiga föreningar. Fastän P. cepacia kan växa på tex, salicylsyra, så är det också giftigt för den. Då är det än viktigare att kontrollera tillförseln näringsämnet eftersom bakterierna dör vid överdosering.