Structural and evolutionary studies of a lipocalin: the alpha1-microglobulin protein and its gene

Abstract: Popular Abstract in Swedish INTRODUKTION Aminosyror är en grupp små molekyler som finns i våra celler. Totalt finns det tjugo olika aminosyror, vilka kan binda till varandra i långa kedjor varvid de bildar proteiner (äggviteämnen). Proteiner ansvarar för en lång rad funktioner i organismen och varje cell i en organism måste därför kunna syntetisera ett par tusen olika proteiner för att kroppen skall kunna fungera. En del proteiner skall användas inne i cellen, andra utsöndras från cellen och utövar sin funktion i dess direkta omgivning eller i helt andra delar av organismen. Vad som i princip skiljer t.ex. en levercell från en cell i hjärnan eller huden är att de producerar olika proteiner, vilket gör att cellerna kan utföra olika typer av funktioner. Hur vet då cellerna i vilken ordning de skall koppla ihop de olika amino-syrorna för att det skall bli rätt protein? Mallen för de proteiner organismen behöver finns lagrade i cellkärnan i form av deoxyribonukleinsyra, DNA, eller arvsmassa. DNA består av fyra olika nukleotider, vardagligt benämnda g, a, t, & c, som binder till varandra i långa strängar, kromosomer. Varje människocell i kroppen innehåller identiskt DNA, fördelat på 46 st kromosomer, vilka utgör det så kallade genomet. Utspridda i genomet finns gener, relativt korta DNA-avsnitt vilka innehåller informationen för proteinsyntes. När cellen får behov av ett visst protein kopieras det DNA avsnitt som ingår i motsvarande gen till ett så kallat mRNA (m står för meddelande) som skickas iväg till en annan del av cellen där själva proteinsyntesen tar vid. Det är ribosomer som kan läsa informationen i mRNAt och koppla ihop de aminosyror som skall ingå i proteinet. Ribosomen läser nukleotiderna tre åt gången och varje sådan triplett kodar för en aminosyra, t.ex. innebär ttc en aminosyra (fenylalanin) och tct en annan (serin). När ribosomen har läst klart en genkopia har det bildats en proteinkedja. Beroende på vilka aminosyror som ingår och i vilken ordning de sitter så kommer proteinet nu att veckas i en för proteinet typisk form. Veckningen är viktig för proteinets funktion, liksom positionen av olika aminosyror i den veckade strukturen. Veckningen stabiliseras genom att närliggande aminosyror interagerar med varandra i olika typer av bindningar. Det finns grupper av gener i ett genom som är tämligen lika varandra. Det beror på att generna inom gruppen härstammar från en gemensam stamgen, vilken under evolutionens gång har duplicerats ett antal gånger. När en gen dupliceras kan den ena av de två upplagorna tillåtas mutera (förändras) i nukleotidsekvensen. Oftast leder mutationerna till att genen blir funktionsoduglig och upphör att vara en gen, men i ett litet antal fall kan det leda till att ett nytt protein bildas. Om det nya proteinet innebär en överlevnadsfördel för organismen kommer den nya genen att blir kvar i genomet. Proteinerna från en sådan grupp av närbesläktade gener uppvisar likheter, framförallt i vecknings-mönster men ofta också i funktion, och sägs ingå i en proteinfamilj. a1-MIKROGLOBULIN Alfa1-mikroglobulin, populärt kallat alfa-ett-mikro (a1m), är ett brunt extracellulärt protein. Ursprungligen hittades a1m i urin från patienter med njurskador, men nu vet man att a1m framför allt finns i blodet och på olika ställen runt mag-tarmkanalen, luftvägarna och i huden. a1m syntetiseras dock framför allt i levern. Funktionen för a1m är fortfarande okänd, men flera egenskaper har observerats som kan vara av betydelse för funktionen. Den bruna färgen är en sådan egenskap. De flesta proteiner är ofärgade, och har de färg så beror det oftast på att proteinet binder till någon molekyl som orsakar pigmenteringen, en kromofor. Vilken kromofor som orsakar den bruna färgen hos a1m vet man inte, inte heller hur eller var molekylen binder till a1m. En annan typisk egenskap hos a1m är att en relativt stor andel av a1m i blodet bildar komplex med andra proteiner. Hos råtta och människa har dessa komplex undersökts, vilket visade att a1m underligt nog binder till helt olika proteiner hos de två arterna. Ett annat märkligt fenomen, men på DNA-nivå, är att genen för a1m även innehåller informationen för ett annat protein, bikunin. Det innebär att när ribosomerna läser genens mRNA så bildas ett stort protein som innehåller både a1m och bikunin, hopkopplade till en enda lång kedja, en precursor. Precursorn klyvs sedan så att fritt a1m och fritt bikunin bildas. Förutom att a1m och bikunin syntetiseras tillsammans finns det ingen som helst känd relation mellan dessa två proteiner. Däremot har a1m släktingar som tillhör samma proteinfamilj, lipokalinerna. Medlemmarna i familjen är en brokig samling proteiner med mycket varierande funktioner. Det gemensamma för lipokalinerna, förutom att de har utvecklats från samma stamgen, är den speciella veckning som gör att varje protein formar en liten skål (Figur 1 på sidan 11). På utsidan av skålen sitter aminosyror som trivs i en vattenbaserad miljö, de är alltså hydrofila (vattenälskare), medan de aminosyror som finns inne i skålen inte gillar vatten lika bra, de är hydrofoba (vattenskyende). Många lipokaliner binder hydrofoba molekyler, t.ex. vissa kromoforer, i den ficka som skålen bildar. AVHANDLINGENS SYFTE, METODER OCH RESULTAT Syftet med min forskning har varit att (a) identifiera vilka delar av a1m-proteinet som är identiska oavsett vilken art det kommer ifrån och (b) se om det finns avsnitt i a1m-genen, vilka har bevarats under utvecklingens gång. Funktionen för a1m kan antas vara densamma hos alla arter, i alla fall hos vertebrater (ryggradsdjur). Identifiering av konserverade delar av proteinet kan eventuellt bidraga till lösningen på den stora frågan; vad a1m har för betydelse i kroppen. Analyserna av a1m har skett på tre nivåer, DNA-, mRNA- och proteinnivå. För att få material till dessa analyser har jag isolerat och strukturbestämt dels a1m-protein från två djurarter, från ko (artikel II) och från rödspätta (artikel III), dels mRNA från två arter, råtta (artikel I) och ko (artikel II), samt DNA från mus (artikel IV). Resultaten användes sedan för jämförelser med resultat som tagits fram av forskargrupper som arbetar med andra djurarter. Resultaten av dessa jämförelser visar att a1m innehåller totalt cirka 180-185 aminosyror, av vilka 38 stycken är identiska i djurarter av så skiftande slag som rödspätta, groda, råtta, ko och människa (Figur 10 på sidan 45). Sju av de konserverade aminosyrorna utgör ett kännetecken för lipokaliner och tros vara involverade i den speciella lipokalinveckningen. Övriga 31 aminosyror är a1m-typiska och kan tänkas ha betydelse för binding av kromoforen, för komplexbildning eller någon annan binding som funktionen är beroende av. Till exempel vet man att cysteinet i position 34 (Figur 10) är inblandat vid samman-kopplingen av vissa komplex. Analyserna visar också att proteinet har flera gemensamma egenskaper mellan arterna, så som färg, form och storlek. Det finns dock skillnader. Proteiner som utsöndras ur celler får ofta kolhydrater (sockermolekyler) kopplade på sig innan de lämnar cellen. Mängden kolhydrater på a1m skiljer sig mycket mellan de olika djurarterna, med groda som den ena extremen som saknar kolhydrater helt och människa å andra sidan med tre stycken bundna kolhydratgrupper. a1m som isolerats från rödspättelever är egentligen a1m som inte hunnit utsöndras från levercellen, det vill säga intracellulärt a1m. Analyserna visade att detta intracellulära a1m också är brunt. Det betyder att vad det än är som gör att a1m är brunt, så finns det inne i cellerna och binder till a1m redan där. Studier av råttleverceller visade att både a1m/bikunin precursorn och fritt a1m finns inne i levercellerna. Det tyder på att precursorn klyvs redan inne i cellen. Med andra ord så skiljs a1m och bikunin åt intracellulärt, för att sedan utsöndras och, efter vad man vet, inte ha mer med varandra att göra. Studierna av a1m-genen visar att det finns många grundläggande likheter mellan mus och människa, de enda två arter för vilka genen är undersökt (Figur 1 i artikel IV). Uppbyggnaden är generellt densamma, även om musgenen är något kortare. Under de cirka 115 miljoner år som gått sedan mus och människa hade en gemensam förfader har det dock skett en del förändringar i nukleotidsekvensen, framför allt i de delar av genen som inte innehåller själva mallen för proteinet, det vill säga intronerna. Vad som bevarats i intronerna är dels element som kan vara involverade i geners förmåga att föröka sig eller hastigt förändra sig, så kallade rekombinogena regioner, dels element som styr när och i vilken cell en gen skall kopieras, genreglerande element. Det är uppsättningen av genreglerande element i a1m-genen som avgör att det framför allt är i leverceller som a1m produceras. SAMMANFATTNING AV RESULTATEN # Trettioåtta stycken aminosyror i a1m av totalt cirka 180 är konserverade i alla undersökta arter. Sju av dessa aminosyror är lipokalinspecifika. # a1m från olika arter har samma storlek, form och färg. # Det finns stora skillnader i kolhydratinnehåll i a1m hos olika arter. # a1m erhåller sin bruna färg redan inne i levercellerna. # a1m och bikunin bildas från ett precursorprotein som klyvs intracellulärt. # Förutom de kodande regionerna i a1m-genen har genreglerande element samt rekombinogena regioner bevarats under utvecklingen.