Pro- and anticoagulant activities of factor V

Abstract: Popular Abstract in Swedish När en skada på ett kärl uppstår sätts blodkoagulationen igång. En rad reaktioner mellan olika proteiner, såsom proenzymer, enzymer och kofaktorer sker då på negativt laddade ytor som exponeras i samband med skadan. Därigenom omvandlas flytande blod till levrat blod och kärlskadan täpps igen. Faktor V är en viktig komponent i blodkoagulationen. I koagulationsprocessens inledning klyvs molekylen av trombin eller faktor Xa, vilket leder till en ökning av faktor V-molekylens prokoagulanta effekt. Den aktiverade formen av faktor V fungerar som en kofaktor till faktor Xa vid aktiveringen av protrombin till trombin. Trombin som genereras kan inte bara aktivera faktor V-molekyler, utan även faktor VIII-molekyler. Strukturellt liknar faktor VIII och faktor V varandra men de har olika funktioner. Aktiverad faktor VIII fungerar som en kofaktor till enzymet faktor IXa vid aktiveringen av faktor X till faktor Xa. Aktiveringen av faktor V och faktor VIII leder till en explosionsartad trombinbildning vilket i sin tur medför bildandet av ett fibrinnät. Fibrinnätet tillsammans med hopade blodplättar bildar en plugg som täpper igen kärlskadan. Okontrollerade koagulations processer medför en risk för blodproppar. Därför finns det ett motverkande system, "antikoagulationen", som nedreglerar koagulationen. Det centrala enzymet i antikoagulations- systemet är aktivt protein C (APC). APC inaktiverar faktor V och faktor VIII och hindrar därmed produktionen av trombin. Balansen mellan aktivering och inaktivering av faktor V och faktor VIII avgör om koagulationen eller antikoagulationen skall överväga. För några år sedan upptäckte professor Dahlbäck att många patienter med venös tromboembolism (blodpropp i ben och lungor) har en resistens mot APC. APC-resistens orsakas av en mutation i faktor V-genen, som leder till att en arginin aminosyra förändras till en glutamin aminosyra i faktor V- molekylen. Detta gör att APC inte kan klyva faktor V i aminosyra position 506, en förutsättning för full inaktivering av faktor V. Resistens mot APC medför ett hyperaktivt koagulationssystem och en ökad benägenhet för blodproppsbildning. Mutationen i faktor V som leder till ett förändrat APC klyvningsställe vid position 506 utgör idag den vanligaste ärftliga orsaken till venös trombossjukdom. Under arbetets gång med att utröna de molekylära mekanismer som orsakar APC-resistens fann Dahlbäck att faktor V kan fungera som en antikoagulant molekyl genom att verka som en kofaktor till APC vid inaktiveringen av faktor VIII. Detta visade på att faktor V har två helt motsatta funktioner, en prokoagulant och en antikoagulant. Mitt avhandlingsarbete har varit inriktat på att studera faktor V- molekylens dubbla funktion. För att kunna genomföra dessa studier har jag etablerat ett system, i vilket celler som normalt sett inte uttrycker faktor V kan göra detta. En rad faktor V-varianter har skapats med hjälp av molekylär-biologiska metoder. Avhandlingen består av fyra delarbeten som beskriver dessa mutanter och deras biologiska effekter, såväl de pro- som de antikoagulanta. I delarbete (I) förändrades tre olika aminosyror som var och en ingår i klyvningsställena för trombin i faktor V. Den prokoagulanta aktiviteten som de olika faktor V-mutanterna uttrycker före och efter aktivering av trombin eller faktor Xa studerades i ett biologiskt system med renade komponenter. Experimenten visade på de tre trombinklyvnings-ställenas betydelse för den prokoagulanta aktiviteten hos faktor V. Vi fann att faktor Xa aktiverar faktor V på samma sätt som trombin d.v.s genom klyvning vid aminosyrorna Arg 709, Arg 1018 och Arg 1545. Faktor Xa klyver dessutom vid en fjärde position Arg 1765. I arbete (II) användes de faktor V-mutanter som beskrevs i delarbete (I) för att vidare studera effekten av de olika trombin- och faktor Xa-klyvningarna i faktor V. För detta ändamål användes olika plasmabaserade system, där vi kunde mäta trombingenereringen var tionde sekund, vilket gav en mycket detaljerad bild av koagulationen. Arbetet visade att klyvningen vid Arg 709 sker snabbast men ger bara en liten ökning av faktor V-molekylens prokoagulanta aktivitet. Maximalt uttryck av prokoagulant aktivitet och maximal trombinbildning uppnås endast efter klyvning vid både Arg 709 och Arg 1545 i faktor V. Klyvning vid Arg 1018 leder inte till någon ökning av prokoagulant aktivitet och därmed inte till en ökad produktion av trombin. I delarbete (III) studerades faktor V-molekylens antikoagulanta funktion. Vi använde oss av de ovan beskrivna faktor V-mutanterna samt av faktor V-varianter, i vilka olika delar av faktor V plockats bort. Mer än hälften av den molekylära massa hos faktor V utgörs av en domän (denna sträcker sig från aminosyra 709 till 1545) som klyvs bort vid fullständig aktivering av faktor V. Så länge denna domän, kallad B-domän, är närvarande kan inte faktor V uttrycka prokoagulant aktivitet. Experiment med monoklonala antikroppar har visat att B-domänen kan ha betydelse för den antikoagulanta funktionen. För att studera detta vidare framställdes faktor V-molekyler där hela B-domänen togs bort (aminosyror 709 till 1545) samt faktor V-molekyler där endast de sista 70 aminosyrorna lämnats kvar. När hela regionen mellan 709 och 1545 togs bort förlorade faktor V förmågan att uttrycka antikoagulant aktivitet. När däremot de sista 70 aminosyrorna i B-domänen lämnades kvar kunde faktor V fortfarande fungera som en antikoagulant. Resultaten visade att faktor V-molekylen uttryckte full antikoagulant aktivitet när den klövs vid Arg 709 och Arg 1018, medan en klyvning vid Arg 1545 medförde en förlust av hela den antikoagulanta funktionen. Detta påvisar den funktionella betydelsen av området omkring Arg 1545 för den antikoagulanta funktionen. Arbetet visar också den balans som föreligger mellan den pro- och antikoagulanta funktionen hos faktor V. Klyvning vid Arg 709 och Arg 1018 leder till en liten ökning av faktor V-molekylens förmåga att fungera som en prokoagulant men ger ingen förlust av antikoagulant aktivitet. Fullständig aktivering av faktor V, som sker i samband med klyvning vid Arg 1545, ger en maximalt fungerande prokoagulant molekyl, men också en molekyl som helt förlorat den antikoagulanta funktionen. I arbete (IV) studerades förmågan hos faktor V att uttrycka antikoagulant aktivitet efter det att varje APC-klyvningsställe (Arg 306, Arg 506 och Arg 679) förändrats till glutaminer (Gln). Resultaten visade att en mutation av Arg 506 till Gln ger en försämrad antikoagulant funktion. Mutationer vid de andra APC-klyvningsställena Arg 306 och Arg 679 hade ingen påverkan på faktor V. Klyvningen vid Arg 506 i faktor V visade sig korrelera med en ökning av den antikoagulanta funktionen. Dessa resultat har bidragit till att öka vår förståelse för de mekanismer som leder till venös trombossjukdom hos individer, där en mutation i faktor V (Arg 506 till Gln) ägt rum. Genom att studera de funktioner faktor V har och hur dessa regleras kan vi på sikt få bättre analys- och behandlingsmetoder för koagulations-rubbningar. Med hjälp av dessa fyra studier har vi kunnat visa att faktor V cirkulerar som ett förstadium till både en pro- och antikoagulant molekyl. Prokoagulant blir faktor V efter att trombin eller faktor Xa aktiverat molekylen. Antikoagulant blir faktor V efter det att APC klyvt faktor V vid position 506. Mutationer i faktor V kan få drastiska konsekvenser. Detta illustreras av det faktum att patienter med en mutation vid position 506 (Arg 506 till Gln) löper en ökad risk att drabbas av venös trombossjukdom. Mutationer i den del av faktor V B-domänen som vi tror är viktig för den antikoagulanta funktionen kan eventuellt också vara vara en riskfaktor för trombos. Försök har därför påbörjats med att analysera DNA från patienter med trombossjukdom för att om möjligt påvisa sådana mutationer.