Insulin Polymorphism Crystallographic Characterization of Insulin Microcrystals

Abstract: Popular Abstract in Swedish Diabetes (Diabetes mellitus) eller sockersjuka som den också kallas, är en sjukdom som beror på att kroppens celler inte kan ta upp socker från blodet, vilket leder till hög blodsockerkoncentration. Socker utsöndras även i urinen vilket kroppen försöker kompensera för genom att också öka utsöndringen av vatten. Detta leder till att stora mängder urin bildas samt att man ofta känner törst vilket är två typiska symptom för diabetes. Kroppens oförmåga att ta upp socker kan bero på två faktorer. Man brukar därför dela upp diabetes i två typer; typ I och typ II. Diabetes typ I beror på att det hormon som signalerar till kroppens celler att ta upp socker saknas eller finns i väldigt liten mängd. Hormonet kallas insulin och är ett protein (äggviteämne) som produceras i bukspottkörteln. Vid avsaknad av eget insulin måste man medicinera med insulinpreparat vilket vanligtvis görs genom injektioner under huden. Insulinmolekylerna i dessa preparat är ofta tätt packade i små kristaller (några hundradels millimeter stora). När kristallerna kommer in i kroppen faller de sönder och insulinet frigörs och tas upp i blodet. Diabetes typ II, som förr kallades åldersdiabetes, är en sjukdom som i regel inträffar senare i livet. Orsaken är inte helt känd men förutom att sjukdomen kan vara ärftlig anses en överdriven fettrik konsumtion, kombinerat med för lite motion ha ett samband. Vid typ II diabetes är det inte mängden insulin som är problemet utan snarare att insulinet inte har tillräcklig effekt. Man brukar säga att patienterna är immuna mot insulin. Ofta kan en förbättrad kosthållning och ökad kroppsaktivitet räcka för att förbättra sjukdomsbilden. Forskning om insulin har pågått sedan insulinets biologiska effekt upptäcktes på 1920-talet. Genom åren har insulin kristalliserats i ett antal olika kristallformer och var ett av de första proteinerna som blev strukturbestämt. Så vad finns det mer att forska om? En av anledningarna till att mycket forskning fortfarande bedrivs kring insulin och dess verkan är att man ännu inte lyckats efterlikna kroppens egna reglering av insulinutsöndring och sockernivåbalans. Dagens patienter är därför tvungna att ta flera insulininjektioner per dag. Bland de olika insulinprodukter som idag finns tillgängliga består en del av kristallinskt insulin. I min forskning har jag arbetat med insulinets strukturella och kristallinska egenskaper. Tekniken för att studera den tredimensionella strukturen av protein och vilken kristalltyp som proteinet är packat i kallas röntgenkristallografi. I korthet bygger tekniken på att proteinet ligger regelbundet packat i kristaller som exponeras för röntgenstrålar. Röntgenstrålarna diffrakteras av proteinets elektroner och intensiteten och riktiningen på de diffrakterade strålarna detekteras med en detektor. Denna information behandlas sedan i flera steg för att så småningom resultera i en tredimensionell struktur av proteinet. Jag har använt två olika former av röntgenkristallografi, där den ena bygger på att man analyserar en kristall i taget, s k enkel-kristalldiffraktion. Det är denna teknik som generellt ger information om proteinets struktur. Den andra tekniken kallas pulverdiffraktion och bygger på att man exponerar hundratals mindre kristaller samtidigt. Informationen från denna teknik ger en mindre detaljerad bild av strukturen men jag har visat att tekniken kan användas för att bestämma vilken kristallform insulinet är packat i. Pulverdiffraktion användes för att karakterisera en rad olika suspensioner av kristallinskt insulin, dels färdiga produkter men framförallt suspensioner som är under utveckling. Kristallernas storlek är oftast så liten att det visuellt är omöjligt att avgöra vilken typ av kristall det är eller om det överhuvudtaget är kristaller eller en utfällning av protein man ser. Pulverdiffraktion ger dock en möjlighet att direkt karakterisera preparaten. Med hjälp av pulverdiffraktion identifierades ett flertal nya kristallformer av insulin. I ett av fallen kunde kristalliseringsbetingelserna modifieras så att större kristaller erhölls, lämpliga för enkel-kristalldiffraktion. Efter att strukturen blev bestämd visade det sig att insulinmolekylerna var packade på ett sätt som inte tidigare varit känt. Genom att öka pH-värdet kunde ytterligare en ny kristallform identifieras som delvis hade samma typ av packning. Packningen av insulinmolekyler kan ha betydelse för den kemiska- och fysiska stabiliteten av både insulinet och kristallerna. Det återstår att se hur mycket den nya packningsformen påverkar dessa egenskaper och om kristallerna är lämpliga för att användas i farmaceutiska insulinpreparat. I en annan studie undersöktes ett komplex av insulin och peptiden protamin (en peptid är en kortare form av protein). Kristaller av detta komplex har under cirka 50 år använts framgångsrikt i behandlingen av diabetes (s k NPH-preparat, Neutral Protamine Hagedorn). Trots det har man aldrig lyckats få en detaljerad bild av hur protamin interagerar med insulin. Sådan information är viktig för att kunna modifiera interaktionen så att en bättre produkt erhålls. Två typer av försök gjordes där insulinet och protaminet i det ena försöket kristalliserdes med urea för att frambringa stora kristaller. Dessa gav mycket detaljerad data men utan att peptiden kunde identifieras. I det andra försöket framställdes kristaller under betingelser som mer liknar det farmaceutiska preparatets. Storleken på dessa kristaller var avsevärt mindre. Istället för att använda pulverdiffraktion användes s k mikrofokuserad röntgenstrålning. Denna teknik är identisk med vanlig enkel-kristalldiffraktion men röntgenstrålen som används är mer fokuserad och har högre intensitet, vilket möjliggör analys av små kristaller. Trots att relativt bra datakvalitet erhölls kunde peptiden inte heller i detta fall identifieras. Detta tyder på att peptiden är mycket flexibel och att dess interaktion med insulin är ospecifik. Sammanfattningsvis har jag visat att både pulverdiffraktion och mikrofokuserad röntgenkristallografi är två mycket användbara metoder för att karakterisera mikrokristaller av insulin.