Membrane protein proteomics - Novel method for membrane protein identification and quantification

Abstract: Popular Abstract in Swedish Membranproteiner är tämligen svåra att digerera med enzym som trypsin. Mindre specifika enzym såsom elastase och pepsin har dock visat sig mer effektiva. Databassökningar med dessa icke-tryptiska peptider är mindre verkningsfulla pga avsaknaden av laddning vid peptidens N-terminal och C-terminal samt brist på sekvensspecificitet. Vi beskriver en metod med specifik N-terminal inmärkning av icke-tryptiska peptider från membranproteiner. Inmärkingen underlättar databassökning och kan dessutom kan användas för relativ kvantifiering. Förhållandena för digerering med det icke-specifika enzymet Proteinase K har optimerats för att peptider med passande längd för MS fragmentering ska erhållas. Vi visar hur effektiv metoden är genom att använda oss av plasmamembran från en leukemicellinje, resultatet är en kraftig ökning i antal membranproteiner som identifieras med små extra-membrandomäner jämfört med tidigare publicerade metoder. Därefter utvecklades metoden ytterligare genom att göra den kvantitativ för membranproteiner. Detta exemplifierades genom analys av en membranfraktion från bakterien Bacillus subtilis som fått växa med eller utan närvaron av 0.5 % glukos. Vi tillämpade en isotopisk inmärkningsstrategi. Resultaten visar en god reproducerbarhet av de uträknade uppregleringarna/nedregleringarna av de identifierade peptiderna inom samma protein. Metoden applicerades sedan på proteiner i plasmamembranet framrenade från cancerceller odlade med eller utan närvaro av syre. Målet var att hitta biomarkörer för vävnadshypoxi.