Exploring Anti-FVIII Antibodies in Haemophilia A - Role in In Vitro Haemostasis and Clinical Disease

Abstract: Popular Abstract in Swedish Hemofili A är en form av blödarsjuka som beror på en medfödd defekt av äggviteämnet faktor VIII (FVIII). FVIII spelar en viktig roll för att kroppens blodlevringsförmåga (s.k. koagulation) ska fungera optimalt och med nedsatt funktion hos FVIII riskerar man att drabbas av allvarliga blödningar i framför allt leder, men även i muskler, slemhinnor (t.ex. näsblödning) och i hjärnan. Ledblödningarna leder till kronisk nedbrytning av leden, s.k. artropati, vilket påverkar patientens rörelseförmåga och även livskvalitet avsevärt. Sjukdomen finns i tre svårighetsgrader baserat på vilken halt av FVIII man kan uppmäta i blodplasman hos patienten: svår, moderat och mild hemofili. Patienter med svår hemofili löper en påtagligt högre risk för spontana svåra blödningar än de övriga grupperna. Den gen som styr produktionen av FVIII är belägen på den kvinnliga könskromosomen, X-kromosomen, och därmed är det (i princip) endast män som drabbas av sjukdomen hemofili (ca 1 av 5000 män). En kvinna kan dock ärva det defekta genanlaget från sin mor och kan, som bärare, i vissa fall drabbas av blödningssymptom. I ca 30% av hemofilifallen finns inte sjukdomen i familjen sedan tidigare, utan beror då på att en spontan nymutation uppstått i FVIII-genen hos den drabbade individen. Sverige har varit ett föregångsland när det gäller hemofilisjukvård. Redan på 1950-talet började Professor Inga Marie Nilsson på Malmö Allmänna sjukhus att introducera förebyggande behandling med FVIII (s.k. profylax) till de blödarsjuka patienterna. Hon och hennes kolleger resonerade så att då patienter med moderat och mild hemofili blöder betydligt mer sällan och inte så allvarligt som patienter med svår hemofili, så borde en högre halt av FVIII i blodplasman hos de svårast drabbade patienterna göra att blödningssymptomen minskar och att sjukdomen då liknar den hos en patient med moderat/mild hemofili. Ganska snart stod det klart att teorin stämde med den kliniska bilden; patienterna blödde mindre frekvent och ledsjukdomen kunde bromsas och t.o.m. förebyggas. Från att ha varit en sjukdom med svåra symptom och en medellivslängd på inte ens 20 år lever svenska hemofilipatienter idag ett väsentligen normalt liv, med normal livslängd och livskvalitet. Profylaxbehandling är idag rekommenderad över hela världen som förstahandsval till pojkar med hemofili. Ett stort hinder är dock att kostnaden för sådan behandling är mycket hög och profylax finns därför inte tillgängligt överallt. FVIII-preparaten som används idag är antingen syntetiska eller framställda från blodplasma från blodgivare. På 1980-talet drabbades en stor del av de blödarsjuka av HIV och/eller gulsot p.g.a. att en del av blodplasman som användes för FVIII-framställning kom från HIV- och/eller gulsotsmittade individer. Katastrofen ledde till att bättre metoder för att rena och avdöda blodprodukter från virus utvecklades och att donerat blod testas mer noggrant. De läkemedel som används idag bedöms vara säkra. En del hemofilipatienter drabbas dock av biverkningar till FVIII-behandlingen där antikroppsbildning (s.k. inhibitorer), som drabbar ca 30% av patienterna med svår hemofili, är den mest allvarliga. Antikroppar är äggviteämnen som cirkulerar i blodbanan och som där bryter ner effekten av FVIII-läkemedlet. Det leder till att patienterna på nytt löper en stor blödningsrisk, både spontant och t.ex. vid kirurgiska ingrepp eller olyckor. Blödningar hos patienter med FVIII-inhibitorer är ofta svårbehandlade. Det finns idag läkemedelsalternativ till FVIII som kan ges till dessa patienter och de preparaten kallas för by-passing-produkter. När man behandlar patienter med FVIII kan man efter injektionen mäta den farmakologiska effekten i blodet. För by-passing-produkter finns inte någon metod tillgänglig i kliniken för att mäta effekten. Den kliniska erfarenheten av bypassing-behandling är att effekten kan variera mellan olika individer och därför är det önskvärt att finna en metod för att vägleda val av dosering och även i viss mån val av specifik by-passing-produkt. Ett annat problem med by-passing-behandling är att kostnaden per injektion är betydligt högre än FVIII-behandling. I två av de delarbeten som diskuteras i den här avhandlingen har by-passingbehandling vid svår hemofili A utvärderats med hjälp av en metod som kallas för ”thrombin generation assay” (TGA). Metoden presenterades första gången i mitten av 1980-talet och har sedan dess utvecklats och modifierats. Med TGA kan man mäta den sammanlagda blodlevringsförmågan i blodplasma från en individ, till skillnad från t.ex. FVIII-mätning där man endast mäter halten av just FVIII. På så sätt får man en mer fullständig bild av blodlevringsförmågan. I det första delarbetet (Paper I) var frågeställningen om by passingbehandling av patienter med hemofili påverkas av ärftliga faktorer. Blodplasma från brödrapar med hemofili blandades med två olika by-passing-produkter i två separata försök och analyserades med TGA. Resultaten visade att blodlevringsförmågan inom ett brödrapar når jämförbara nivåer vid tillsats av bypassing-produkter, men att två obesläktade individer varierar betydligt mer i blodlevringsförmåga vid by-passing-behandling. Resultaten indikerar att det kan finnas en ärftlig faktor som styr hur väl vår koagulation fungerar. Inom hemofilisjukvården skulle man kunna använda sig av kunskapen om hur en familjemedlem har svarat på behandling med by-passingprodukt om ytterligare en individ inom samma familj behöver liknande behandling. För att säkert veta detta behöver man dock utvärdera effekten i större patientmaterial. I det andra delarbetet (Paper II) användes TGA för att utvärdera behandlingseffekten av en kombination av by-passing-behandling och FVIII. Det har tidigare observerats hos patienter med inhibitorer att de, trots närvaro av de FVIII-hämmande antikropparna, blöder mindre om de behandlas med FVIII. Hypotesen i delarbete två var därför att tillsats av FVIII eventuellt kan förstärka effekten av by-passing-produkten. Flera olika FVIII-produkter testades som tillägg till två olika by-passing-produkter. Resultaten från försöken visade att tillägget av FVIII gav en förstärkt, additiv, effekt på blodlevringsförmågan mätt med TGA(additiv: effekten av läkemedel 1 + effekten av läkemedel 2 = dubbel effekt; jfr 1+1=2). I vissa fall var effekten t.o.m. synergistisk, vilket innebär att tillsatsen av FVIII gav en extra skjuts till blodlevringen utöver den uppmätta additiva effekten (jfr. 1+1>2). Resultaten talar för att denna strategi skulle kunna användas för behandling hos i alla fall patienter med svåra blödningar där endast by-passingprodukt inte ger tillräcklig effekt. Hämmande antikroppar mot FVIII (inhibitorer) mäts med en särskild metod som kallas för Bethesda-metod. Den metoden kan dock inte upptäcka alla sorters antikroppar. Man vet sedan tidigare att det bildas olika sorters FVIII-antikroppar i kroppen, både hos hemofilipatienter, men också hos friska individer. Vilken funktion eller effekt dessa antikroppar har på FVIII är oklart. Vissa studier har visat att de kan inverka negativt på effekten av FVIII-läkemedel, medan andra studier har visat att så inte är fallet. I delarbete III-V användes en metod som kallas för ELISA för att hitta FVIII-antikroppar i blodplasma från patienter med hemofili. Två stora patientgrupper undersöktes; en grupp av bröder med hemofili (n=201) och en grupp med obesläktade individer med hemofili (n=78). En frågeställning i båda studierna var om olika typer av FVIII-produkter kan påverka bildandet av FVIII-antikroppar på olika sätt och i olika grad. Därför testades plasmaproverna mot tre olika FVIII-produkter som är vanliga vid behandling av hemofili. Resultaten visar att ca 19% av bröderna och ca 13% av de obesläktade individerna bildar FVIII-antikroppar och att fynden av FVIII-antikroppar varierar beroende av vilken FVIII-produkt som används i experimenten. Teoretiskt kan man tänka sig att en individ bara producerar antikroppar mot just den produkt de själva använt, men något tydligt sådant mönster fann vi inte i studierna. I brödrastudien ingick ett antal individer som genomgått behandling syftande till att oskadliggöra inhibitoriska FVIII-antikroppar (ITI) och när prover från dessa individer analyserades fann vi att ca 25% av dem hade kvarstående FVIIIantikroppar, men av annan typ än de hämmande antikropparna. Vi fann också att en grupp patienter som hade drabbats av inhibitorer tidigare hade blivit av med dessa spontant utan aktiv ITI. Detta fynd är intressant då ITI-behandling är tidskrävande, omfattande för patienten och mycket kostsam. Om man bättre kan välja ut patienter som verkligen behöver den skulle mycket vara vunnet. Den obesläktade patientgruppen följdes över en tidsperiod av ca fyra år och flera blodprover insamlades under den tiden. Analys av proverna visade att produktionen av FVIII-antikroppar varierade över tiden på så sätt att en individ uppvisade ett positivt svar vid ett provtagningstillfälle för att sedan inte producera några antikroppar vid nästa provtagningstillfälle. Flera, redan kända, riskfaktorer för bildande av inhibitoriska FVIII-antikroppar (t.ex. FVIII-mutation, ålder, kirurgiskt ingrepp och gulsotinfektion) utvärderades i relation till FVIIIantikroppsutfallet utan att vi fann någon koppling till dessa riskfaktorer. mycket intressant fynd i långtidsobservationen av obesläktade individer var att patienter som någon gång under studietiden bildade FVIII-antikroppar blödde signifikant mindre än den grupp av patienter som inte bildade några antikroppar. Orsaken till detta fynd är ännu oklar, men kan indikera att det kan finnas en typ av FVIII-antikroppar som skyddar eller t.o.m. förstärker FVIII-effekten i blodet. Framtida studier får utvisa.