The EGF-like Modules of Anticoagulant Protein S. Studies of Ca2+ binding and module interactions

Abstract: Popular Abstract in Swedish I samband med en kärlskada startar en kaskad av reaktioner som leder fram till bildandet av ett blodkoagel. Det är viktigt att bildandet av blodkoagel begränsas till det skadade området. Blodkoagulationen är därför reglerad av antal antikoagulanta system av vilka det viktigaste är protein C systemet. I detta system samverkar aktivt protein C (APC) tillsammans med ett annat protein, kallat protein S. En brist på endera av dess två proteiner medför en ökad risk att drabbas av blodpropp. Protein S är uppbyggt av fyra olika regioner, s. k. moduler (schematiskt illustrerad i figur 5 på sidan 22). Den första modulen innehåller karboxylerade glutaminsyror (Gla), en speciell aminosyra som kräver vitamin K för att bildas. Gla- modulen ansvarar för bindningen av protein S till de negativt laddade ytor som exponeras på blodplättar (trombocyter) och cellmembraner från skadade celler. Nästa del av molekylen består av den thrombin känsliga delen. Protein S kan här klyvas av thrombin, ett enzym i blodet som främjar koagulationen. En klyvning i denna region medför att protein S ej längre kan fungera som hämmare av blodkoagulationen. Den tredje regionen består av fyra moduler som var och en liknar den epidermala tillväxtfaktorn (EGF). EGF är ett litet protein som stimulerar differentieringen av vissa celltyper, en egenskap som saknas hos de EGF-lika modulerna i protein S. I de fyra EGF-lika modulerna finns ytterligare modifierade aminosyror, b-hydroxyasparagin (Hyn) och b-hydroxyaspartat (Hya). Den fjärde och sista delen av proteinet består av en modul som kallas för SHBG-delen och som liknar ett protein i kroppen som heter SHBG ‘sex hormone binding globulin‘. SHBG fungerar som transportprotein för manligt könshormon i blodet. Någon liknade funktion av SHBG-delen i protein S har ej dokumenterats. Däremot är denna del involverad i bindningen till ett annat protein, C4b-bindande protein (förkortat C4BP), vilket är en del av kroppens immunförsvar. I blodet cirkulerar 30-40 % av protein S som fria molekyler medan resterande 60-70 % återfinns bundna till C4BP. Endast den delen av protein S som cirkulerar som fria molekyler fungerar som koagulationshämmare, dvs de 60-70 % som befinner sig i komplex med C4BP påverkar ej koagulationen. Denna avhandling behandlar framförallt EGF-modulernas kalciumbindande förmåga och deras delaktighet i interaktioner mellan protein S och andra proteiner i blodkoagulationen. För att kunna studerea detta isolerades de EGF-lika modulerna i protein S antingen var för sig eller i kombination. De ensamma modulerna EGF 3 och 4 syntetiserades kemiskt och veckades till en nativ konformation. Med hjälp av baculovirus i insektceller producerades EGF 1-4, EGF 1-3, EGF 2-3 och EGF 2-4. Dessa protein fragment karakteriserades med avseende på konformation, renhet och Hya/Hyn-innehåll. Då insektcellerna ej kunde vecka EGF 3-4, producerades detta par i bakterier varefter modulerna veckades till nativ konformation. För att bestämma kalciumaffiniteten hos de enskilda modulerna och de EGF innehållande fragmenten användes NMR-teknik (kärnmagnetisk resonans) samt metoder som utnyttjar kromofora kelatorer. Detta har gjort det möjligt att vis att de ensamma EGF-lika modulerna 3 och 4 i protein S innehåller var sitt kalciumbindande site (ung. ställe, ficka) med relativ svag affinitet. Kalciumaffiniteten är i samma styrka som tidigare har dokumenterats för ensamma EGF-lika moduler från andra koagulationsproteiner. När kalciumaffiniteten studerades i EGF 3-4 paret visade det sig däremot att affiniteten i det C-terminala sitet (slutet av molekylen, i detta fall EGF 4) hade ökat 8600 ggr jämfört med affiniteten i den ensamma modulen. Det kalciumbindande sitet i EGF 3 binder dock med samma affinitet i paret och som ensam modul. Därmed framgår det att den huvudsakliga effekten på kalciumbindning skapas av modulen N-terminalt (framför) om den som binder. När EGF 1-4 och 2-4 undersöktes fann jag bl.a. att dessa fragment innehåller två mycket högaffina kalciumbindande site, med 1000-100 000 ggr högre affinitet för kalcium än motsvarande ensamma EGF-lika moduler. Dessa två site tros befinna sig i modul 3 och 4. Om EGF 4 däremot saknas, såsom i fragment EGF 1-3 och 2-3, uteblir den mycket höga kalciumaffiniteten i EGF 3. EGF 4 tycks således ha den högsta kalciumaffiniteten och den påverkar affiniteten i EGF 3 med en faktor av ~230 och EGF 2 med en faktor av ~25. Detta tyder på att också moduler C-terminalt (efter) om den kalciumbindande modulen påverkar kalciumaffiniteten. Fragmenten utnyttjades också för att studera om och i så fall vilka av de EGF-like modulerna i protein S som är involverade i interaktionen med APC. Med hjälp av en metod som registrerar hur lång tid det tar för plasma att koagulera, studerades fragmentens förmåga att tränga undan bindningen mellan protein S och APC. Endast de fragment som innehöll EGF 1 hade förmågan att påverka interaktionen. EGF 1-4 hade dessutom en 10 ggr starkare inhibitorisk effekt än EGF 1-3. Det tyder antingen på att det finns en svag interaktion mellan EGF 4 och APC eller att EGF 4 behövs för att hålla EGF 1 i en optimal konformation för interaktion med APC. Då en antikoagulant aktivitet, oberoende av APC, tidigare hade föreslagits för protein S användes fragmenten och de ensamma modulerna även för att studera en eventuell interaktion mellan protein S och faktor X (ett av de prokoagulanta proteinerna). I ett fast fas system lyckades alla EGF fragmenten utkonkurrera intakt protein S i dess interaktion med faktor X, medan ingen påverkan kunde påvisas med de ensamma modulerna. Ej heller sågs någon effekt av felveckat EGF 3-4 eller av ett kalciumbindande EGF modulpar från ett orelaterat protein. Den fysiologiska relevansen av en protein S-faktor X interaktion är dock fortfarande oklar. De kalciumbindande studierna liksom experimenten där interaktionerna mellan protein S och andra proteiner studerades indikerade att modul-modul interaktioner är viktiga för den biologiska funktionen av protein S.