Staphylococcal induced inflammatory response in human monocytes: Analysis of factors involved

Abstract: Popular Abstract in Swedish Den medicinska termen sepsis, "blodförgiftning" orsakas av bakterier i blodet. Symptombilden kan variera från tämligen lindriga förlopp till septisk shock, som har en hög dödlighet. Vid sepsis och septisk shock aktiveras olika kroppsegna system såsom koagulations- och komplementsystemet. Många mekanismer medieras av så kallade cytokiner. Dessa budbärarmolekyler byggs upp av proteiner och kolhydrater och frisätts av olika celltyper. De verkar framförallt på den egna cellen, närliggande celler och i vissa fall på avlägsna celler. Vid utvecklingen av sepsis och septisk shock anses tumor necrosis factor-alfa (TNF-alfa), interleukin-1beta (IL-1beta) och interleukin-6 (IL-6) vara de viktigaste cytokinerna i det initiala skedet. Såväl Gram-negativa bakterier (t ex Escherichia coli) som Gram-positiva bakterier (t ex stafylokocker) stimulerar celler till produktion av ovan nämnda cytokiner. Tidigare forskning har framförallt koncentrerats på Gram-negativa bakterier och man vet att lipopolysackarid (LPS, endotoxin), en cellväggskomponent hos Gram-negativa bakterier, är ansvarig för stimulering av vita blodkroppar till TNF-alfa, IL-1beta, och IL-6 frisättning. Antalet fall av Gram-positiv sepsis har ökat stadigt de senaste 15 åren och är nu lika vanlig som sepsis orsakad av Gram-negativa bakterier. Staphylococcus aureus och Staphylococcus epidermidis tilhör de fyra vanligaste bakterierna som orsakar Gram-positiv sepsis. Antalet fall väntas stiga p g a ökad användning av allehanda protesmaterial, katetrar och immunsupprimering. Vissa Gram-positiva bakterier utsöndrar toxiner, vilka man vet kan utlösa septisk shock, men även icke-toxinproducerande bakterier kan utlösa detta tillstånd. Sannolikt kan cellväggsprodukter från Gram-positiva bakterier stimulera celler till cytokinfrisättning, men mycket inom detta område är okänt. Vi isolerade cellväggskomponenterna peptidoglykan (PG) från S. aureus och S. epidermidis och teichoic syra (TA) från S. epidermidis. PG är en stor stel molekyl som är uppbyggd av kolhydrater och proteiner. Den utgör 50-60% av cellväggen. TA består av glycerol eller ribitolmolekyler som är sammanlänkade med fosfatgrupper. TA utgör cirka 30-40% av cellväggen. Avhandlingen grundar sig på fem vetenskapliga uppsatser vilka samtliga handlar om hur stafylokocker stimulerar till TNF-alfa frisättning, och i delarbete I även interleukin-1beta, och IL-6 frisättning från humana monocyter. Första delarbetet visar att PG och TA isolerade från S. epidermidis inducerade TNF-alfa, IL-1beta, och IL-6 från humana monocyter på ett koncentrationsberoende sätt. Även PG från S. aureus stammar inducerade dessa cytokiner (ej visat). I jämförelse med LPS från Gram-negativa bakterier var PG och TA svaga stimulus, nästan 1000 gånger mer PG per viktsenhet krävdes för att nå samma nivåer TNF-alfa och IL-1beta, och 100 gånger mer per viktsenhet för att erhålla samma IL-6 nivåer. Det är sedan länge känt att serumfaktorn lipopolysackarid-bindande protein (LBP) ökar LPS effekt påtagligt för bl a TNF-alfa produktion. I delarbete III har vi studerat hur serum påverkar PG och dess förmåga att stimulera TNF-alfa frisättning från humana monocyter. Serum hade en uttalad potentierande effekt på PG. PG koncentrationen för att uppnå mätbara nivåer TNF-alfa i våra tester var 1000 gånger lägre om serum (10%) var närvarande. Vid PG-koncentrationer (10-1000 ug/ml) var komplementfaktorer troligen ansvariga för den förstärkande effekten. Vid PG-koncentrationer 10 ug/ml och högre spelade immunoglobulin G en viktig förstärkande roll. Vi konkluderar att i närvaro av serum är LPS och PG nästan lika potenta att stimulera till TNF-alfa frisättning från humana monocyter. I delarbete II jämfördes PG´s TNF-alfa inducerande förmåga från 3 stammar S. epidermidis och S. aureus. Inga signifikanta skillnader förelåg mellan de olika PG-preparationerna. Vidare undersökte vi om PG´s storlek hade någon betydelse för dess effekt på TNF-alfa sekretionen. PG-molekylerna behandlades antingen med olika specifika enzymer eller sonikering, som gör molekylerna mindre. De allra minsta fragmenten (muramyldipeptid) erhölls kommersiellt. Studien visar att TNF-alfa frisättningen minskade med minskad storlek på PG; för att ej vara mätbar med minsta komponenten muramyldipeptid. Storleken på PG molekylen spelar alltså en viktig roll för dess TNF-stimulerande effekt i humana monocyter. Mycket forskning inriktar sig på att finna ett komplement till antibiotika vid sepsis och septisk shock. Ett tänkbart alternativ är att använda en substans som blockerar bildningen av TNF-alfa, som är en av nyckelmediatorerna i sepsis och septisk shock. Då en monocyt stimuleras med t ex LPS aktiveras olika "vägar" inne i cellen för att slutligen aktivera den gen som kodar för TNF. Ett sätt att studera detta är att inhibera intracellulära vägar med olika substanser. I delarbete IV visade vi att LPS och PG aktiverade delvis samma intracellulära vägar för TNF-alfa frisättning. Vi fann dock två skillnader mellan LPS och PG; protein kinas C var aktiverat i LPS-stimulerade celler men spelade en mindre roll i celler stimulerade med PG. Vidare fann vi att ett specifikt tyrosin kinas protein var involverat i PG-stimulerade celler men ej i LPS-stimulerade. Vi testade också substanserna pentoxifyllin, chloroquin, och apozynin, som redan använts på människa eller i djurmodeller, för dess TNF-inhiberande effekt. Alla tre substanserna inhiberade TNF-frisättning på ett dosberoende sätt oberoende av om cellerna stimulerats med LPS eller PG. Tidigare studier har visat att om E.coli behandlas med antibiotika, som har olika verkningsmekanismer, frisätts varierad mängd LPS i omgivande medium och som en konsekvens av detta olika nivåer TNF-alfa efter stimulering av monocyter. I arbete V behandlade vi S. epidermidis med tre grupper antibiotika med olika verkningsmekanismer: penicllin och oxacillin, som stör nysyntes av bakteriens cellvägg, vancomycin som också inhiberar nysyntes av bakteriens cellvägg men via en annan mekanism, och klindamycin som hämmar nybildning av proteiner. Efter behandling med antibiotika filtrerades bakterierna bort. Supernatanten användes därefter för att stimulera monocyter och sedan kvant ifiera TNF-alfa frisättning. Penicillin- och oxacillinsupernatanterna inducerade högst nivåer TNF-alfa, framförallt i närvaro av serum. Det förelåg 10 gånger högre koncentration av lösligt PG och 5 gånger högre koncentration av frisatt TA i penicillin- och oxacillinsupernatanterna jämfört med de andra supernatanterna. Det är känt sedan tidigare att dessa cellväggsprodukter frisätts från Gram-positiva bakterier vid behandling med penicilliner, och likaså att de inducerar cytokiner. All data sammantagna indikerar att lösligt PG och TA var de huvudsakliga komponenterna i penicillinsupernatanterna ansvariga för TNF-alfa frisättning. Den kliniska relevansen av denna in vitro studie är oklar eftersom TNF kan ha både positiva och negativa effekter vid en infektion. Emellertid visar studien att det inflammatoriska svaret kan variera beroende på vilket antibiotika som ges.