Mechanisms of Transgene Silencing in Neural Cells -Implications for Ex Vivo Gene Therapy to the Brain

Abstract: Popular Abstract in Swedish Ett nytt och experimentellt sätt att bota eller lindra sjukdomssymptom är att, istället för att tillföra en medicin, rätta till felet på en genetisk nivå. Detta kan åstadkommas genom att överföra nya, fungerande gener, sk transgener, till celler som då börjar producera protein, som i sin tur kan ge upphov till en terapeutisk effekt. I hjärnan skulle denna typ av behandling kunna ge en lokal frisättning av tex tillväxtfaktorer, som har visats kunna skydda nervceller från att dö vid neurodegenerativa sjukdomar. Det fi nns två olika sätt att överföra gener till hjärnan: Antingen tillsätts genen direkt till hjärnans celler (in vivo genterapi) tex med hjälp av virus, eller också modifi eras celler genetiskt i kultur för att sedan transplanteras till önskat område (ex vivo genterapi). Det finns fördelar och nackdelar med båda metoderna. In vivo genterapi, har visat sig ge långvariga och höga nivåer av det önskade proteinet. Problemet med denna metod är att det är svårt att kontrollera vilka celler som den nya genen överförs till, hur många kopior av genen som integrerar i cellens genom och var i genomet de hamnar. Detta har visat sig kunna ge allvarliga konsekvenser. Ex vivo genterapi har däremot fördelen att man kan kontrollera för dessa faktorer innan cellerna transplanteras till hjärnan. Denna metod ger också en möjlighet att eventuellt kunna ersätta celler som dött pga neurodegenerativ sjukdom eller stroke. I min avhandling har jag främst studerat det största problemet med ex vivo genterapi: att genuttrycket nedregleras när celler transplanteras till hjärnan. Jag har studerat transgenuttryck i genetiskt modifi erade celler, som tidigare visat sig vara lämpade för transplantation till just hjärnan, i kultur under olika förhållanden samt efter transplantation till hjärnan på råttor. Jag har kunnat visa att transgener, precis som vid transplantation, nedregleras om odlingsförhållandena ändras till att efterlikna miljön i hjärnan. Detta sker i takt med att cellen slutar dela sig och börjar uppvisa en mer mogen neural karaktär (differentiering). Detta har gett mig möjlighet att in vitro studera mekanismerna som ligger bakom nedregleringen. Bland annat har jag, med hjälp av inhibitorer, kunnat visa att mekanismer som ligger bakom kondensering av kromatin är viktiga för nedreglering av transgenuttryck. Dessa mekanismer är bland annat modifi eringar av de proteiner som organiserar cellens DNA, histonprotein, och jag har i detalj studerat vissa av dessa modifi kationer i de överförda transgenerna. Jag har kunnat visa att det fi nns ett samband mellan en typ av histonmodifi ering (adderandet av acetylgrupper på histon3) och transgenuttryck i delande celler. För även i celler som delar sig har vi detekterat att transgener inte uttrycks i lika stor omfattning från olika integrerade kopior. Den kraftiga nedregleringen som sker vid diffrentiering verkar däremot inte höra ihop med just de histonmodifi eringar jag har studera. Jag försökte även att förhindra nedregleringen av transgenen vid differentiering genom att hämma kromatinkondensering före transplantation, alternativt genom att omgärda transgenen med sk insulatorer. Insulatorer är små DNA-sekvenser, som i tidigare studier visat sig kunna hämma spridning av kromatinkondensering och härmed skydda mot nedreglering. Båda sätten visade sig ha en detekterbar effekt, men främst på celler som inte hade differentierat ut till mogna neurala celler. Det visar återigen att de mekanismer vi har undersökt inte helt och hållet kan förklara den problematiska nedregleringen av transgener man ser vid transplantation, men resultaten i denna avhandling har ändå gett oss ökad vetskap om de bakomliggande orsakerna. Detta kommer förhoppningsvis kunna resultera i en framtida fungerande ex vivo genterapi.