Secretory Leukocyte Protease Inhibitor (SLPI) in the gastrointestinal tract in man

Abstract: Popular Abstract in Swedish Sedan urminnestider har vi utsatts för attacker av virus, bakterier och andra för kroppen skadliga ämnen. Som svar på detta har kroppen utarbetat ett speciellt försvarssystem, det så kallade immunsystemet. När kroppen angrips aktiveras immunsystemet som står färdigt att bekämpa inkräktaren av vad slag det vara månde. Till sin hjälp har det många förfinade verktyg. Bland dessa finns tex. de vita blodkropparna. Dessa förfogar över mäktiga vapen som kan spys ut över inkräktaren, sönderdela cellväggarna och digerera cellkomponenterna. I stridens hetta görs ingen skillnad på vän och fiende, egna celler tar skada liksom angriparens. När angreppet är över måste kroppen åter börja bygga upp det som förstörts. De ämnen som använts i försvaret är bland annat sk. proteaser, ämnen som bryter ned proteiner (äggvita). För att hålla systemet i balans finns också sk. antiproteaser, ämnen som specifikt motverkar effekten av proteaser. Secretory Leukocyte Protease Inhibitor (SLPI) är ett sådant antiproteas. Det är speciellt utvecklat för att ta hand om proteaser utsöndrade från de vita blodkropparna, Mest kända proteaserna härifrån är elastas och cathepsin G. Bland andra kända proteaser kan nämnas trypsin som utsöndras från bukspottskörteln i samband med att vi bryter ned maten. Från bukspottskörteln utsöndras också ett elastas som dock har en något annorlunda uppbyggnad än det som utsöndras från de vita blodkropparna. Balansen mellan proteaser och antiproteaser är viktig och en förutsättning för att kroppen ska kunna hämta sig efter infektioner. En sjukdom där detta inte fungerar på tillfredsställande sätt är till exempel Ulcerös Colit (UC). UC är en inflammatorisk tarmsjukdom som leder till kroniska inflammationer i tarmen med diare´, blod i avföringen samt buksmärtor. Orsaken till UC är fortfarande okänd, defekter i immunsystemets reglering har föreslagits. Tidigare studier på patienter med UC har visat att avföringen innehåller ett överskott av proteaser, både elastas från vita blodkroppar men även trypsin och elastas från bukspottskörteln. Hos friska människor finns inget sådant proteas överskott. SLPI har ett verkningsområde som är specifikt riktat mot dessa proteaser. Målet för denna avhandling har varit att kartlägga förekomsten av SLPI i magtarmkanalen och att försöka påvisa om SLPI är inblandat i de inflammatoriska processerna vid UC. SLPI är ett ämne som produceras i slemhinnorna i olika delar av kroppen. Det upptäcktes först i genitalia, senare har man funnit stora mängder i slemhinnorna i de stora luftrören. Den slutliga karaktäriseringen av uppbyggnaden gjordes i slutet på åttiotalet av professor Kjell Ohlson i samarbete med doktor R Thompson. SLPI kunde då renas från spottkörtlarna där det produceras i stora mängder. Av en slump noterades att SLPI fanns i bukvätska hos patienter som opererades för akut bukhinneinflammation på grund av tex. blindtarmsinflammation eller brustet magsår osv. Detta kunde antyda att SLPI producerades någonstans i magtarmkanalen, något som tidigare varit okänt. Arbete I I det första arbetet togs vävnad tillvara i samband med operationer för olika former av cancer i magtarmkanalen. För att påvisa om SLPI fanns i cellerna i vävnaden användes en metod kallad ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay). Ett sinnrikt system av olika antikroppar som reagerar specifikt på SLPI tillsätts och med ett reagensämne får man en färgning av antikropps-SLPI komplexet. Vi använder ofta ett reagensämne som ger en brunröd infärgning (se omslaget). Förekomst av SLPI i vävnaden kunde därvid påvisas och bindas till speciella celltyper, sk. Paneth celler som finns i tunntarm och bägarliknande celler som finns i tjocktarm och tunntarm. SLPI hittades också i en del tjocktarmspolyper. Arbete II Eftersom SLPI produceras i spottkörtlarna sväljs stora mängder ned med saliven varje dag. I det andra avhandlingsarbetet undersöks därför huruvida detta nedsvalda SLPI kommer ned i tarmkanalen i aktiv form eller om det bryts ned på vägen dit. I magsaften produceras stora mängder saltsyra som har till uppgift att just bryta ner proteiner så att vi skall kunna tillgodogöra oss maten. SLPI är emellertid mycket motståndskraftigt mot syrabehandling, teoretiskt skulle det därför kunna passera genom magsäcken och vidare ner i tarmarna. Via en slang sprutades radioaktivt märkt SLPI in i början av tunntarmen nedanför magsäcken. Sedan mättes radioaktiviteten i blod, urin och avföring. Inget intakt radioaktivt märkt SLPI kunde återfinnas varken i blod, urin eller avföring. SLPI bröts uppenbarligen ner trots att det sprutades in en bit ner i tunntarmen. Fortsatta försök visade att SLPI bröts ner såväl av magsaft som av tunntarmsaft. Pepsin, ett ämne som bildas i magsaften bröt mycket effektivt ner SLPI under kort tid. Det SLPI som bildas i saliv och luftvägar bryts ned i magsaft/tunntarmssaft och har därför sannolikt inte någon betydelse för den inflammatoriska balansen i tjocktarm/tunntarm. Arbete III Stora mängder tarmsaft produceras dagligen av bukspottkörteln. I tarmsaften finns de proteaser som bryter ned maten, tex. trypsin, elasta. Dessa proteaser är de samma som tidigare visades finnas i överskott hos akut sjuka patienter med UC. I det tredje arbetet undersöktes förekomsten av SLPI i bukspottkörteln, samt om bukspottkörteln själv kan tillverka SLPI. Ett specialbehandlat bukspottkörtel-extrakt inköptes för detta ändamål. Detta innehöll cellens byggstenar för produktion av alla de ämnen som bukspottkörtelcellerna producerar. Dessa byggstenar (RNA) är kroppens system att från DNA molekylen göra ”ritningar” av de proteiner som ska produceras. Med rt-PCR metoden (reverse transkriptase Polymerase Chain Reaction) kan de unika RNA molekyler som används för att bilda SLPI väljas ut, massproduceras och sedermera färgas för specifik identifikation. Detta arbete visade att bukspottkörteln innehåller de byggstenar som används för produktion av SLPI. Vidare gjordes en färgning av bukspottkörtelvävnad med ELISA teknik där samma snitt blev färgat först blått pga. förekomst av insulin, som enbart förekommer i en viss celltyp, Langerhans cellöar. Samma snitt av vävnaden färgades sedan med ett reagens ämne som färgades rött pga. förekomst av SLPI. Resultatet blev en blålila färgton beroende på att SLPI och insulin fanns i samma celler dvs de insulinproducerande Langerhanska cellöarna Detta arbete påvisade således produktion av SLPI i bukspottkörtelvävnad, dessutom påvisades närvaro av SLPI i de Langerhanska cellöarna i bukspottkörteln. Arbete IV I det fjärde arbetet undersöktes blod och avföring på 15 patienter som insjuknat med akut UC. Tyvärr kunde inte så många patienter lämna avföringsprover att mängderna kunde analyseras statistiskt på ett meningsfullt sätt. Dock kunde SLPI påvisas i avföringen både hos friska normalpersoner och hos patienter med akut UC. Det visade sig att blodet innehöll SLPI i betydligt högre mängder än hos friska normal personer. SLPI hos patienter med UC visade sig också vara kopplat till sjukdomsgraden, så att lindrigare sjukdom gav lägre värden och svårare sjukdom gav högre värden. Efter tillfrisknande mättes värdena hos nio av de 15 patienterna igen och SLPI värdet hade då sjunkit, men var fortfarande förhöjt jämfört med friska. SLPI koncentrationen i blod varierar således med sjukdomsgraden och SLPI förefaller aktivt vara inblandat i de inflammatoriska processerna vid UC. SLPI värdena blev emellertid inte normala ens efter återhämtandet vilket talar för att UC är en kronisk sjukdom där sjukdomsprocessen alltid är mer eller mindre aktiv. Vidare mättes koncentrationen av NGAL (Neutrofilt Gelatinase Associerat Lipocalin), ett ämne som finns i de vita blodkropparna och som troligen har betydelse för bekämpningen av bakteriella infektioner. Andra studier har visat att förhöjda värden av detta ämne kan konstateras hos patienter med akut UC. Detta ämne mätt i avföring har visat sig vara kopplat till sjukdomsgraden vid UC. I vår studie var NGAL koncentrationerna i blod förhöjda både vid den akuta sjukdomen som senare efter återhämtandet. Värdena mellan proverna vid akut sjukdom och efter återhämtandet skilde sig så pass mycket att detta ämne troligen skulle kunna vara användbart för att bestämma om patienter med UC befinner sig i aktiv sjukdomsfas eller i återhämtnings fas. Detta skulle kunna vara av värde vid fortsatta studier av patienter med denna sjukdom. Andra ämnen som studeras var bland andra TNF-@ (Tumor Necrosis Factor). Detta ämne är intressant eftersom det är effektivt i behandling av en annan inflammatorisk tarmsjukdom nämligen Mb Crohn. Denna tamsjukdom har en annan symtomatologi och är oftast lokaliserad till tunntarmen Detta ämne har också provats i försöksverksamhet mot UC med uppmuntrande resultat. TNF-@ har uppenbarligen en viktig roll som regulator av den inflammatoriska processen. I vår studie visade sig detta ämne också vara förhöjt vid det akuta insjuknandet men inte efter återhämtandet. Vi mätte också koncentrationen av elastas i blod. Eftersom det påvisats ett överskott av detta proteas i avföringen hos patienter med akut UC kunde det möjligen också finnas förhöjda mängder i blodet. Mängden elastas i blodet var emellertid inte förhöjd jämfört hos friska. Arbete V I det femte arbetet utarbetades en metod för att odla mänskliga celler från tjocktarmen, och sedan utföra mätningar på odlingsmediet. Olika ämnen som cellerna utsöndrar kan mätas både i normalfallet och vid sjukdom. För att kunna skapa sig en uppfattning om hur mycket ämne som utsöndras relaterat till den studerade mängden vävnad användes sk. stansbiopsier. Slemhinnan fripreparerades först med sax från omkringliggande bindväv och ”stansades” sedan med ett stansverktyg med olika bestämda diametrar (3,4 eller 6 mm). Därefter lades vävnaden i odlingsbad. Det visade sig att SLPI utsöndrades i odlingsmediet i alla tagna vävnadsbitarna. Vidare att mängden utsöndrat ämne variera med omkretsen på vävnadsbiten. Detta skulle kunna bero på det direkta trauma cellerna utsattes för i samband med stansningen men möjligen också en indirekt (skadad till oskadad) cell signal. Exakt vad som stimulerar frisättning av SLPI från tjocktarmsslemhinna är ännu inte klarlagt. Denna metod kommer att användas vid fortsatta försök där tjocktarmsslemhinna stimuleras med olika inflammations stimulerande respektive inflammationsdämpande substanser, både på frisk slemhinna och på patienter som måste opereras pga. Akut UC. Konklusioner Sammanfattningsvis har avhandlingen visat att SLPI förekommer i slemhinnan i både tunntarm och tjocktarm. Dessutom i en del tjocktarmspolyper. SLPI förefaller vara involverat i de inflammatoriska processerna vid UC. Förhöjda värden av anti proteaset SLPI har visats i blodet vid akut UC. Trots detta har man i tidigare arbete kunnat visa att det finns ett överskott av proteaser i avföringen hos patienter med akut UC. Det vore önskvärt att begränsa den lokala effekten på tjocktarmsslemhinnan av de proteaser som har visats finnas i överskott i tjocktarmen hos patienter med akut UC. SLPI tillfört som tex. lavemang skulle kunna prövas i denna avsikt. SLPI varierar med sjukdomsgraden hos patienter med akut UC. Även hos patienter efter återhämtning är SLPI värdena förhöjda. Detta skulle kunna tala för att UC är en kronisk systemisk sjukdom, där tarmen snarare är måltavla för de inflammatoriska processerna än den utlösande orsaken. Stansbiopsi metoden utvecklades för att odla human tjocktarmsslemhinna och kvantitativt bestämma förekomsten av olika utsläppta ämnen i odlingsmediet. På detta vis kan effekten av olika tillförda ämnen kvantitativt studeras både på frisk som sjuk slemhinna. NGAL i blod är inte beroende av sjukdomsgraden vid UC. Liksom SLPI är värdena efter återhämtning fortfarande förhöjda jämfört med normala friska. Blodkoncentrationen vid akut sjukdom var emellertid så pass mycket högre än de tagna efter återhämtandet att NGAL sannolikt skulle kunna användas som markör för patienter med aktiv pågående UC kontra patienter i återhämtningsfas.