Metabolic analysis of shikimic acid producing Escherichia coli

Abstract: Popular Abstract in Swedish Efterfrågan på shikimsyra, vilken återfinns i biosyntesvägen för bl.a. de aromatiska aminosyrorna tryptofan, fenylalanin och tyrosin, har under de senare åren ökat. Orsaken till detta är mestadels att den är råmatrial till antiinfluensamedicinen Tamiflu?. Den ökade efterfrågan har drivit fram nya tillverkningsmetoder såsom produktion via E.coli- fermentation. Även om man har lyckats att nå en industriellt gångbar process finns det fortfarande problem rörande E.coli:s shikimsyrametabolism som måste lösas för att nå en optimal produktion. I denna avhandling presenteras en stude där syftet var att öka förståelsen av metabolismen i en shikimsyraproducerande typ av E.coli för att i förlängningen möjliggöra en optimering av processen. Olika tekniker såsom traditionella fermentationmetoder, RNA-uttrycksanalys (transcriptome analysis), fluxanalys (MFA) och 2-dimensionell (2-D) fluorometri användes. Fermentation (mestadels kemostat) under kolbegränsning och kolrika förhållanden (mestadels fosfatbegränsning) utgjorde basen för studierna. 2-D-fluorescensmätningar användes främst för att studera stabiliten hos E.coli i kemostatmiljö. Bakgrunden till denna delstudie var ett känt problem av instabilitet av plasmidinnehållande E.coli-stammar, vilket shikimsyrastammen var ett exempel på. Två huvudproblem, vilka orsakar ett minskat shikimsyrautbyte är kända. Det ena rör biproduktbildning av andra metaboliter i shikimsyravägen (d.v.s. DHS, DHQ och quinat) och det andra rör totalutbytet av alla shikimsyravägsprodukter vilket av någon anledning är mindre under vissa förhållanden. Mekanismerna bakom dessa problem är inte kända men ett par förklaringsmodeller för biproduktsbildningen diskuteras. I denna avhandling visas att kolbegränsning i jämförelse med fosfatbegränsning faktiskt har den största potentialen till optimerad shikimsyraproduktion eftersom totalutbytet här är störst. Dock på bekostnad av en större biproduktbildning. RNA-expressionsanalysen lyckades ge en ökat förståelse för båda ovan beskrivna problem genom att påvisa en uppreglering av vissa gener under kolbegränsning som kunde kopplas till båda dessa fenomen. Fluxanalysen lyckades ytterligare öka förståelsen genom att modellera mekanismen som styr tillflödet till shikimsyravägen. Eftersom de använda metoderna är globala i sin natur kunde även fenomen som inte direkt var kopplade till shikimsyraproduktionen studeras. Bland annat kunde ?overflow?-metabolism påvisas under fosfatbegränsning, detta blev särskilt tydligt i fluxanalysen. Expressionsanalysen visade också att cellerna under kolbegränsning kände av en viss brist på de aromatiska aminosyrorna vilket inte var fallet under fosfatbegränsning. Resultaten från 2-D-fluorescensmätningarna visade att shikimsyrastammen var tillräckligt stabil för att ett tillfredställande steady-state skulle uppnås i kemostaterna, men under alla förhållanden kunde adaptionsprocesser observeras. Tillväxt under selektionstryck ökade inte stamstabiliteten nämnvärt. Det visade sig också att denna teknik kunde påvisa mer information om metabolismförändringar kopplade till adaptionsprocesser än vad de traditionella metoderna lyckades med.