Experimental Traumatic Brain Injury and Cell Death - in vivo and in vitro aspects

Abstract: Popular Abstract in Swedish Hjärnskador till följd av skallskador (traumatiska hjärnskador) eller otillräckligt blodflöde (cerebral ischemi) är en av de vanligaste orsakerna till död och invaliditet i västvärlden. De vanligaste orsakerna till traumatiska hjärnskador är fordonsolyckor, fall och våldshandlingar. Cerebral ischemi ses vid en rad kliniska tillstånd, såsom slaganfall (stroke), hjärtstillestånd och gravt sänkt blodtryck. Förutom den tragedi och lidande som drabbar den skadade och dennes närstående är också kostnaderna för samhället i form av vård- och rehabilitering samt produktionsbortfall höga. Traumatiska- och ischemiska hjärnskador kallas ofta akuta hjärnskador i motsats till kroniska skador såsom Alzheimers och Parkinsons sjukdomar. Kunskapen om skademekanismerna efter akuta hjärnskador har ökat betydligt under de senaste två decennierna, men tyvärr finns för närvarande ingen etablerad farmakologisk behandling som fungerar kliniskt. Möjligheterna att utveckla en neuroprotektiv behandling har dock ökat betydligt, och fortsätter att öka i takt med forskningsinsatser inom fältet. Skademekanismerna efter akuta hjärnskador är komplexa och i många avseenden lika- t.ex. leder ofta traumatisk skada till en störning i cirkulationen med ischemi som följd. Skadeförloppet brukar delas in i primära och sekundära skador. De primära skadorna uppträder omedelbart vid skadetillfället, och förhindras främst genom preventiva åtgärder (bilbälten, airbags, hjälmar, reducering av riskfaktorer etc.). De primära skadorna leder till en rad förändringar i signalering, metabolism, blodflöde etc. som i sin tur leder till utvecklingen av sekundära skador. De sekundära skadorna uppträder ofta i distinkta regioner av hjärnan (t.ex. i subregioner av hippocampus; s.k. selektiv neuronal celldöd) med en fördröjning efter själva skadetillfället, och fortsätter därefter att utvecklas under en längre period (månader-år). Fördröjningen är intressant ur ett kliniskt perspektiv, eftersom det innebär en möjlighet att farmakologiskt bromsa skadeutvecklingen. Flera olika experimentella neuroprotektiva terapier har testats med gott resultat i djurmodeller, men tyvärr har ingen av dessa visat effekt i kliniska prövningar. Den uteblivna effekten kan bero på att prövningarna varit dåligt upplagda, att skadorna i människa är mer heterogena än i djurmodellerna, eller helt enkelt att viktiga mekanismer för skalltrauma i människa ännu inte identifierats. Akuta hjärnskador leder till förlust av nervceller och därmed förmågor och färdigheter, vilket är orsaken till att någon form av invaliditet är vanligt efter skadan. Funktionsbortfallets art och omfattning beror på skadans lokalisering och storlek, och handikappen delas ofta in i kognitiva och motoriska dito. Då neuroprotektiva strategier testas i djurexperimentella modeller är det viktigt att förutom mätning av skadans storlek även studera funktionell förbättring i form av motoriska och kognitiva förmågor. I delarbete I utvärderas ett test för motorisk koordinationsförmåga i råtta (The rotating pole test) efter experimentell traumatisk skallskada, och resultaten visar att testet är användbart för att utvärdera skada och återhämtning. De sekundära hjärnskadorna är komplexa till sin natur och är en konsekvens av att de primära skadorna orsakat förändringar i cellen och vävnaden. Som tidigare nämndes har traumatisk hjärnskada ofta ett inslag av försämrad cirkulation och därmed ischemi. Det har visat sig att prostacyclin har positiva effekter på genomblödning i en rad kliniska situationer, inklusive traumatisk hjärnskada. Ovanligt nog har inte prostacyclin testats i en djurmodell av traumatisk hjärnskada, vilket vi gjorde i delarbete II. Resultaten visade att prostacyclin ledde till en signifikant minskning av skadevolymen efter experimentell traumatisk hjärnskada, men den motoriska funktionen förbättrades inte. Mitokondrien är en central faktor i utvecklingen av de sekundära skadorna (s.k. mitokondriemedierad celldöd), varvid celldödsinducerande faktorer, t.ex. cytochrome c frisätts. Frisättning av cytochrome c kan ske genom att porer i det inre mitokondriemembranet öppnas, varvid mitokondrien svullnar, och det yttre membranet spricker. Fenomenet kallas mitochondrial permeability transition, och blockeras av cyklosporin A (CsA), vilken också visat sig ha en mycket starkt neuroprotektiv effekt i djurmodeller av akuta hjärnskador. Eftersom celldöden ofta sker i små regioner innebär det att det finns mycket begränsade mängder vävnad tillgängliga för att studera mekanismerna bakom celldöden. Beträffande mitokondrier har detta tidigare varit ett problem, eftersom de flesta etablerade tekniker för att studera mitokondriefysiologi kräver större mängder prov. Mot denna bakgrund utvecklades en flödescytometrisk metod för analys av isolerade hjärnmitokondrier (delarbete III). Med denna metod är det möjligt att mäta membranpotential, produktion av fria radikaler samt morfologiska mått (svullnad) i mycket små prover. Metoden tillämpades därefter för att jämföra mitokondrier från olika subregioner av hippocampus (CA1 och CA3), vilket är intressant eftersom CA1-cellerna är känsligare än CA3-cellerna efter cerebral ishemi. Vi fann att mitokondrier från CA1-celler producerade mer fria radikaler, samt lättare genomgick mitochondrial permeability transition vid ökade calciumnivåer. Vi tror att dessa skillnader i egenskaper hos mitokondrier från de olika subregionerna är en del av förklaringen till varför CA1-cellerna är känsligare än CA3-cellerna efter cerebral ishemi. Man har tidigare trott att hjärnans nervceller inte kan nybildas, och att de nervceller man föds med därför skall utgöra en fungerande hjärna under hela livet. Under senare år har det visats att en viss nybildning av nervceller sker i hjärnan (s.k. neurogenes), men det är ännu oklart i vilken omfattning detta sker och vilket praktisk betydelse det har. Klart är iallafall att hjärnans nervceller i högre grad än de flesta andra celler är beroende av att fungera under långa tidsperioder, vilket innebär att cellerna behöver effektiva system för att skydda sig mot skador. Dessa endogena skyddsmekanismer kan aktiveras om hjärnan utsätts för en stress som i sig inte orsakar någon celldöd (t.ex. en kort period av syrebrist). Fenomenet kallas ishemisk prekonditionering och skyddar hjärnvävnaden mot en längre, och normalt skadlig period av syrebrist. En ökad kunskap om vilka mekanismer som är inblandade i ischemisk prekonditionering kan således ge viktiga ledtrådar för utveckling av nya neuroprotektiva strategier. I delarbete IV studerade vi hur genuttrycket förändras i samband med prekonditionering, och identifierade en rad gener som selektivt uppregleras efter prekonditionering. En av dessa var Uncoupling protein 2 (UCP-2), vilket är ett mitokondriellt protein. För att studera den neuroprotektiva effekten av UCP-2 utsatte vi celler eller möss (transgener) som överuttryckte proteinet för skadligt låga nivåer av syre och glukos (oxygen-glucose deprivation; cellkultur), experimentell fokal ishemi och experimentell traumatisk hjärnskada (transgena möss), och jämförde omfattningen av celldöd med kontrollceller/ kontrolldjur. Vi fann att celldöden minskade väsentligt vid ett ökat uttryck av UCP-2, och dessutom att de transgena djuren visade en förbättrad funktionell återhämtning efter skada. Resultaten visar att UCP-2 är neuroprotektivt genom att sänka mitokondriens membranpotential något i samband med skada, och därmed minska calciumupptag och produktion av fria radikaler, samt minska risken för mitochondrial permeability transition och aktivering av celldödskaskader. Dessutom visar resultaten att UCP-2 kan delta i cellsignaleringen genom att frisätta fria radikaler i cytoplasman. Denna signalering har tidigare visat sig kunna aktivera transkriptionsfaktorer, och därmed öka uttrycket av neuroprotektiva gener. Fynden i de i denna avhandlingen ingående studierna kan ha relevans för utformandet av nya neuroprotektiva terapier. Som tidigare nämnts har prostacyclin redan använts kliniskt, men biverkningar i form av blodtrycksfall har minskat användningen. Vi visar här att en låg dos av prostacyklin som är jämförbar med den endogena produktionen har en neuroprotektiv effekt. Uncoupling-proteiner har tilldragit sig ett stort intresse eftersom de är involverade i fettmetabolism, och därmed ett intressant mål för behandling av fetma. Således finns det farmakologiska substanser som ökar uttrycket av uncoupling-proteiner, vilka därmed även har en neuroprotektiv potential.