Genetic Characterization of Bone and Soft Tissue Tumors

Abstract: Popular Abstract in Swedish Ben, brosk och mjukvävnad (utgörs av den tvärstrimmiga muskulaturen, fettväv och fibrös bindväv, men också av det perifera nervsystemet) är vävnader av mesenkymalt eller neuroektodermalt ursprung. De flesta tumörer som uppstår i dessa vävnader är godartade och blir därför ofta inte föremål för behandling, vilket gör det svårt att uppskatta incidensen i befolkningen. Enligt Socialstyrelsen diagnostiserades 69 nya fall av bentumörer och 268 nya fall av bindväv/muskeltumörer i Sverige 2002, vilket motsvarar en incidens på 0.8 respektive 3 personer per 100 000 individer/år. Det relativt låga antalet kliniskt uppmärksammade fall av ben och mjukvävstumörer (BMT), samt det faktum att mer än 140 olika typer av BMT finns beskrivna, har medfört diagnostiska och prognostiska problem. Kromosomanalyser av BMT (ca 2500 fall finns rapporterade i litteraturen) har dock visat att många av dessa tumörer uppvisar ett återkommande mönster av kromosomförändringar som kan kategoriseras som "enkla" eller "komplexa". Enkla förändringar innebär oftast enstaka kromosomavvikelser, framförallt balanserade translokationer, som resulterar i fusionsgener. Bildandet av fusionsgener leder till ett överuttryck av t.ex. transkriptionsfaktorer och tillväxtfaktorer, vilket resulterar i ökad celldelning. I dagsläget har ett 40-tal fusionsgener beskrivits i totalt 18 olika typer av BMT. Vissa fusionsgener är specifika för en viss tumörtyp, medan andra fusionsgener finns beskrivna i ett flertal olika tumörer, t.o.m. i tumörer av olika ursprung såsom i blodet och skelettet. Till de enkla förändringarna hör också t.ex. ringkromosomer, som trots ett likartat utseende kan vara uppbyggda av olika genetiska sekvenser (amplifierade gensekvenser, fusionsgener) i olika tumörtyper. Att hitta en enkel, specifik, kromosomförändring är mycket betydelsefullt framförallt vid särskiljandet av morfologiskt likartade tumörtyper. Prognostiskt sett så har man dock bara ett fåtal exempel på samband mellan en viss typ av fusionsgen och kliniskt förlopp. Ännu mindre vet man om de komplexa kromosomförändringar som utmärker vissa BMT, men oftast leder dessa förändringar till ett överskott av vissa kromosomfragment och förlust av andra. Detta kan ha betydelse för aktivering av onkogener (driver celldelning), och inaktivering av tumörsupressorgener (hämmar celldelning). Inget tumörspecifikt mönster har ännu beskrivits i BMT med komplexa kromosomförändringar. Baserat på resultaten från tidigare kromosomanalyser av BMT, har syftet med detta avhandlingsarbete varit att med olika genetiska analysmetoder vidare undersöka ett urval av tumörassocierade kromosomförändringar. Tillvägagångssättet har varit att först avgränsa områden som ofta är inblandade i strukturella förändringar och sedan leta efter målgener i området; alternativt har det funnits en känd målgen och då har dess inblandning i en viss tumörtyp undersökts. En genomgång av alla publicerade fall (år 2001) av fettvävstumörer visade att strukturella förändringar i, eller förlust av, kromosom 13 fanns beskrivna i 16% (72/463) av dem. Syftet med den första studien (artikel I) var därför att med fluorescence in situ hybridisering (FISH) lokalisera brottspunkterna och avgränsa deletionerna i totalt 27 fall med strukturella förändringar av långa armen av kromosom 13 (13q). Analysen omfattade ett område på ca 22.5 Mb (motsvarar ca 20% av kromosomen), som innehåller ett antal gener som är inblandade i olika tumörtyper: BRCA2 (13q12), LHFP (13q13) och RB1 (13q14). I 4 fall var förändringen balanserad och i 23 fall var den obalanserad, med deletion av kromosom 13-material. Storleken på det deleterade området varierade mycket från fall till fall, och kan därför ha haft många olika implikationer. Emellertid så visade resultaten att ett ca 2.5 Mb stort område i band 13q14, distalt om RB1 genen, var deleterat i minst 20 av de 23 fallen. Trots att ännu inga målgener som skulle kunna vara inblandade i utvecklingen av fettvävstumörer har hittats i området, så tyder resultaten på att deletion av ett begränsat område av 13q är av betydelse för uppkomsten av vissa lipomatösa tumörer. Trots att endast 21 fall av godartade brosktumörer (kondrom) med kromosomförändringar hade rapporterats år 2002, så var det tydligt att förändringar i långa armen av kromosom 12 (band 12q13-15) var återkommande i dessa tumörer. Dessutom hade det visats att HMGA2 genen var målet för 12q13-15 förändringar i olika godartade mesenkymala tumörer. Under fosterstadiet uttrycks HMGA2 genen i alla celler, men den är sedan avstängd i de flesta vuxna celler, där en onormal aktivering leder till ökad celldelning. HMGA2 kan aktiveras genom en brottspunkt mitt i genen vilket leder till förlust av de två sista exon, eller genom en brottspunkt utanför genen som troligtvis slår ut regulatoriska sekvenser. Syftet med den andra studien (artikel II) var att med FISH och reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) fastställa huruvida HMGA2 genen var rearrangerad, och därmed uttryckt, även i brosktumörer. Totalt undersöktes 6 mjukdelskondrom och samtliga 4 fall med 12q-förändringar uttryckte HMGA2. I 3 fall med 12q-förändringar fanns brottspunkten mitt i HMGA2, efter exon 3. Ett av dessa fall uppvisade en t(3;12)(q27;q15), och i detta fall återfanns en HMGA2-LPP fusionsgen, identisk med den som tidigare hittats i två andra typer av godartade mjukdelstumörer. I det fjärde fallet var brottspunkten utanför HMGA2. I de två fallen utan 12q-förändringar uttrycktes inte HMGA2, antydande att även andra mekanismer är av vikt för tumörutvecklingen. Två skelettkondrom undersöktes också. Ett fall med 12q-förändring uttryckte HMGA2, och brottspunkten fanns mitt i genen. Även det andra fallet uttryckte HMGA2, men brottspunkten fanns utanför genen. Ett antal elakartade brosktumörer (kondrosarkom) undersöktes också, men inget samband mellan kromosomförändringar och HMGA2 uttryck kunde hittas. Detta skulle kunna förklaras av svårigheter att korrekt fastställa brottspunkterna vid kromosomanalysen, samt att ett stort antal oidentifierbara kromosommarkörer, möjligtvis innehållande 12q-material, fanns i tumörerna. Den tredje studien (artikel III) inleddes med ett fall av en oklar spolcellstumör som vid kromosomanalys uppvisade en t(7;12)(p22;q15). De respektive brottspunkterna kartlades med FISH-analys och två målgener kunde slutligen identifieras: ACTB i band 7p22 och GLI i band 12q13. RT-PCR analys visade att translokationen ledde till en ny fusionsgen: ACTB-GLI. Därefter analyserades 4 nya spolcellstumörer med t(7;12)(p21?22;q13-q15), och i samtliga fall återfanns en ACTB-GLI fusionsgen. I 2 av de totalt 5 fallen återfanns även en reciprok GLI-ACTB fusionsgen. ACTB genen är kraftigt uttryckt i alla celler förutom muskelceller, och kodar för ett protein som bygger upp cytoskelettet, d.v.s. cellens stomme. GLI genen kodar för en transkriptionsfaktor som är den sista länken i en intracellulär signaleringskedja: "sonic hedgehog signaling pathway". Denna kedja är mycket viktig under fosterutvecklingen, men i vuxen vävnad, förutom i testiklar och i livmoder, uttrycks normalt inte GLI. En abnorm aktivering GLI, via komponenter i "sonic hedgehog signaling pathway", eller genom amplifiering av GLI, har beskrivits i olika tumörer. Aktivering av GLI, genom en fusion med en annan gen, såsom dessa fynd visar, hade dock ej tidigare beskrivits. Även om man ej kan utesluta att förlust av GLI genens 5´-ände är av betydelse, så är det troligt att den viktiga konsekvensen av uppkomsten av ACTB-GLI fusionsgenen är att ACTB genens starka promotor leder till ett överuttryck av de GLI sekvenser som är viktiga för vidare aktivering av andra gener. Histologiska undersökningar visade att dessa 5 spolcellstumörer var väldigt lika varandra också morfologiskt, och att de skiljde sig från tidigare beskrivna tumörtyper. Troligtvis har de ett pericytärt ursprung och tumörerna har givits benämningen "pericytom med t(7;12)", för att belysa både deras morfologiska och cytogenetiska kännetecken. I den sista studien (artikel IV), undersöktes brottspunkterna i de 5 tidigare fallen av "pericytom med t(7;12)" på DNA nivå med genomisk PCR. Resultaten stämde väl med RT-PCR fynden. När en fusionsgen bildas sker brott i respektive gen oftast i intron, och sådana s.k. klassiska fusionsgener återfanns i 3 av fallen. I de 2 andra fallen fanns brottspunkterna i exon av ACTB eller GLI. I det ena fallet ledde detta till en trunkering av den sekvens som kodar för en DNA-bindande domän av GLI proteinet, men detta har troligtvis ingen betydelse för proteinets aktivitet. I det andra fallet var brottspunkten i ACTB kombinerad med en submikroskopisk inversion. Sammantaget var samtliga fall obalanserade på DNA-nivå, även om translokationen på kromosomnivå var balanserad i 4 av 5 fall. Trots att kunskapen kring vad som orsakar en translokation är väldigt begränsad, har det visat sig att korta DNA sekvenser, som är gemensamma för respektive genpartner, troligtvis är av betydelse vid translokationer i sarkom. I de 5 fallen som analyserats återfanns sådana DNA sekvenser vid brottspunkterna, men inga långa repetitiva sekvenser, såsom Alu-sekvenser, eller inbindnings-ställen för olika enzym som främjar rekombinering mellan DNA, kunde påvisas. Det verkar därför som att fusionen mellan ACTB och GLI inte kräver någon utbredd homologi, vilket är förenligt med tidigare beskrivningar av translokationer i sarkom.