NADH:quinone oxidoreductase: the black box of the respiratory chain

Abstract: Popular Abstract in Swedish Komplex I eller NADH:kinon oxidoreduktas är det största och mest komplexa av de fem membranbunda enzymkomplexen som utgör den mitokondriella andningskedjan. Enzymet finns i alla typer av organismer från bakterier till däggdjur. Enzymet katalyserar oxidationen av NADH, som producerats i citronsyracykeln, och reduktion av fettlösligt kinon i membranet. Flavin och ett antal järn-svavel kluster deltar i elektrontransporten genom enzymet, som är kopplad till proton pumpning över membranet. Enzymet kan också katalysera den omvända reaktionen, d.v.s. NAD+ reduktion som drivs av membranpotentialen. Till skillnad från de andra enzymkomplexen i andningskedjan, där man vet förhållandevis mycket om struktur och funktion har man för Komplex I enzymet ingen detaljerad information om strukturen, som endast har bestämts med låg upplösning och dessutom är den molekylära mekanismen bakom kopplingen mellan elektrontransport och proton pumpning är inte känd. För att studera den funktionella mekanismen hos Komplex I och för att kunna formulera en hypotes för hur protonpumpningsmaskineriet fungerar som kan testas experimentiellt, är det nödvändigt att veta hur många inbindningsställen för kinon det finns. I den här studien har vi undersökt funktionen hos specifika inhibitorer som förhindrar inbindning av kinon till Komplex I. Vidare har vi syntetiserat azido-kinonanaloger för direkt inmärking av inbindningställen. Dessa föreningar är stabila i mörker med reagerar med polypeptider vid belysning med UV-ljus. Tre av azido-kinonanalogerna fungerade som substrat för Komplex I och visade normal inhibitorkänslighet. Två av föreningarna blockerade Komplex I vid belysning, vilket visar att specifik inmärkning ägde rum. Vi har också konstruerat fusionsproteiner för att bestämma transmembrantopologin på en av de proteinsubenheter som är en kandidat för att binda kinon. Det Komplex I som finns i däggdjurs mitokondrier består av 46 olika proteinsubenheter medan det bakteriella enzymet endast består av 14 subenheter. Detta enklare Komplex I från bakterier är ett attraktivt modellsystem eftersom biokemiska och biofysikaliska metoder kan användas i kombination med molekylärbiologiska tekniker. Med hur generellt giltiga blir resultaten när man studerar ett modellsystem? I det här arbetet har vi gjort en detaljerad, parallell studie av de katalytiska aktiviterna och känsligheten mot inhibitorer hos det bakteriella och det mammala Komplex I enzymet. Det finns väldigt lite kunskap om vilken funktion de 32 extra subenheterna i mammalt Komplex I har. För vissa subenheter, som till exempel acyl carrier protein (ACP), finns det möjligen specifika funktionella roller. Men ofta anses de extra subenheternas betydelse vara strukturell eller att isolera enzymet och förhindra bildandet av fria radikaler. Med bioinformatiska metoder har vi visat att de flesta av dessa extra Komplex I subenheter måste ha funnits på plats i Komplex I i den ursprungliga eukaryota cell som sedan gav upphov till växter, djur och svampar. Förutom ACP har vi också hittat homologer till fyra andra av de extra Komplex I-subenheterna i bakteriers genom. Särskilt intressant är att vi bara hittar sådana homologa protein i alfaproteobakterier, som är den grupp av bakterier som mitokondrien utvecklats ifrån.