Fast isolation of proteins from bioreactors using affinity chromatography techniques

Abstract: Popular Abstract in Swedish Materien strävar efter största möjliga oordning (entropi). Det krävs ett aktivt ingripande (energitillskott) för att ordna och separera saker. Har man väl hällt salt i teet är det svårt att ta bort, och byta ut det mot socker. Vid framställningen av olika ämnen får man ofta ut en blandning som även innehåller sådant man inte vill ha, och måste hitta sätt att skilja dem åt. En typ av tillverkningsprocess där uppreningen är väldigt viktig återfinns i läkemedelsindustrin. I takt med de naturvetenskapliga och medicinska framstegen har man börjat förstå orsaken bakom, och lärt sig att bota allt fler sjukdomar. I vissa fall saknar patienten ett visst protein, som t.ex. bristen på insulin hos patienter som lider av sockersjuka. Kanske kommer man i framtiden att kunna bota dem genom att rätta till felaktiga gener hos patienten, så att kroppen själv kan börja producera proteinet. Än så länge får man nöja sig med att kunna kopiera in den gen som kodar för proteinet i t.ex. bakterieceller som man kan odla i en stor tank, en bioreaktor, och sedan rena upp det därifrån och ge det till patienten. Så kan man göra när man vill tillverka proteiner för andra ändamål också. Många typer av föroreningar i läkemedel kan orsaka allergier eller andra biverkningar, därför är kraven på renhet extra höga. För att få det så rent krävs flera reningssteg och kontroller. Ofta blir därför uppreningen dyrare än själva framställningen av proteinet. Om man kunde komma på bättre metoder som gör att uppreningen blir enklare och går snabbare, skulle denna typ av mediciner bli billigare och därmed tillgängliga för fler mänskor. Företagen som tillverkar dem är naturligtvis också väldigt intresserade av att hitta bättre metoder, så att det hela blir mer lönsamt och mer konkurrenskraftigt gentemot andra företag. Jag har arbetat med en uppreningsmetod, affinitetskromatografi, och försökt att hitta sätt att göra den snabbare och bättre. Bioreaktorer Kontroll av bioreaktorn. Bakterier växer överallt och är ofta oönskade. När man har en gen som kodar för ett visst protein som man vill tillverka, kan man sätta in den i någon sorts cell (en bakterie, jästcell eller animaliecell), som har lätt för att växa och på så vis få cellen att producera proteinet. Tyvärr brukar de inte vara lika lätta att odla när man har manipulerat med dem. Man måste hitta rätt odlingsbetingelser (temperatur, pH, näringsämnen, syretillförsel osv) för att förmå dem att producera så mycket som möjligt. Ofta måste man prova sig fram tills man hittar en bra kombination. Även sedan man gjort det kan det vara svårt att odla cellerna, eftersom de kan växa olika fort olika gånger, och plötsligt ändra upptag och produktion av olika ämnen. För att märka detta innan det är för sent, och rätta till situationen, vill man kunna mäta vad som händer i reaktorn. Vissa saker är lätta att mäta, som t.ex. pH och temperatur, annat kan vara mycket svårare. Om man vill veta hur mycket produkt som bildats måste man oftast ta ut ett prov ur reaktorn och analysera det. Om analysen tar lång tid hinner förhållandena i reaktorn ändra sig mycket innan man får resultatet, och man vet bara vad man borde ha gjort då, när man tog provet, men inte hur läget är nu. Därför försöker man utveckla snabba, enkla metoder för att mäta det man vill veta om tillståndet i reaktorn. Provtagning och analysmetoder för bioreaktorer Helst skulle man förstås bara montera in en sensor i reaktorn som mätte allt vad man vill veta. Det finns sensorer för många olika ämnen. De har en yta som kommer i kontakt med provet. Antingen sker då en mätbar reaktion direkt på ytan eller så tränger prov in genom ytan och analyseras på något sätt inne i sensorn. Ett problem med användning av sensorer i bioreaktorer är att om det börjar växa celler på denna yta kan det påverka mätresultaten. Sensorn måste också tåla att rengöras så att inte ovälkomna bakterier följer med in i reaktorn, och många sensorer klarar inte av så hårda rengöringsprocesser som krävs. En sensor kan heller inte mäta vad som finns inne i cellerna, (såvida den inte är instucken i en cell). Därför måste man ofta ta ut prov, döda cellerna, ibland slå sönder dem och kanske t.o.m. rena upp det man vill mäta på, innan man kan göra själva mätningarna. Då kan man behöva använda samma metoder som vid uppreningen av produkten, men kan kanske hoppa över några av reningsstegen. Beroende på vilken analysmetod man sedan väljer, varierar det väldigt hur rent provet måste vara och vilken information man får ut. Upprening När en cell tillverkar ett protein kan den antingen släppa ut det i lösningen utanför cellen, eller lagra upp det någonstans inne i cellen. Om det lagras inne i cellen måste man först slå sönder den för att få tag i proteinet. När det väl är ute måste man hitta sätt att skilja det från allt annat som finns i lösningen. Vad finns där då för något? Jo naturligtvis finns ju resterna av cellerna, och alla näringsämnen som cellerna behövt för att kunna växa, sedan finns det också en massa andra proteiner som cellen har tillverkat för att kunna leva, och vatten och salter. Celler och partiklar (~ 0,005 mm) kan man ta bort genom att centrifugera eller filtrera provet. När man vill skilja molekyler (~ 0,00005 mm) åt kan man också utnyttja deras fysiska egenskaper, som storlek och laddning. Det finns många olika uppreningsmetoder, nedan beskrivs tre kromatografimetoder för separation av framför allt biomolekyler. Kromatografi I den vanligaste formen av kromatografi använder man en kolonn, dvs ett rör, som man fyller med små kulor (~ 0,1 mm) gjorda av ett poröst material. Det porösa materialet kallas matris eller gel. Man pumpar sitt prov genom kolonnen. Porerna gör att man får en stor kontaktyta mot provet. I gelfiltrering är det själva porstorleken som bestämmer separationen. Provet och alla lösningar som man använder till en vanlig kromatografikolonn måste vara filtrerade så att det inte finns några rester av celler, oupplöst salt eller några andra partiklar kvar. Annars kan de täppa till kanalerna mellan kulorna och hindra vätskan att rinna genom. Gelfiltrering Små molekyler tränger in i alla porer och det tar därför lång tid för dem att ta sig genom kolonnen. Större molekyler kommer inte in i lika många porer och transporteras därför genom kolonnen fortare. Jonbyteskromatografi Man kan också separera med avseende av laddning. På en laddad yta fastnar molekyler med motsatt laddning. Proteinets laddning är olika vid olika pH. Genom att använda ett lämpligt pH kan man delvis bestämma vilka molekyler som skall fastna. Affinitetskromatografi Vissa molekyler passar så bra ihop att de fastnar i varandra. I kroppen tillverkas antikroppar för att känna igen ett visst protein. Om man sätter fast antikroppar på en yta kan man använda den för att fiska upp de molekyler man vill ha. Affinitetskromatografi Affinitetskromatografi är en mycket effektiv metod för proteinrening. Det protein man är intresserad av kan fångas upp ur en stor volym prov, som innehåller många föroreningar. Man behöver bara pumpa provet genom kolonnen så att proteinet fastnar. Sedan kan man ändra på något t.ex. pH och få sin molekyl att lossna igen och komma ut (eluering). Ofta är proteinet då väldigt rent, kanske 1000 gånger renare än när man började. Nackdelen är att vissa ligander (t.ex. antikroppar) är ömtåliga och tål inte så tuff behandling som behövs för att göra kolonnen ren efteråt, därför tar man ofta först bort det värsta skräpet med någon robustare metod. En vanlig proteinuppreningsprocedur kan se ut så här: Homogeninsering (sönderslagning av celler). Centrifugering för att ta bort cellrester. Jonbyteskromatografi tar bort diverse föroreningar och proteinet kan sedan fås ut i en ganska koncentrerad lösning. Affinitetskromatografi som tar bort nästan alla återstående föroreningar. Gelfiltrering för säkerhets skull. Här kan man även byta buffert om man vill. Frystorkning tar bort vattnet och man får ut proteinet som ett pulver. I varje reningssteg förlorar man en del av proteinet man vill rena upp. I början finns det dessutom med ämnen i lösningen som specifikt förstör protein. Även senare utsätts det ofta för miljöer det inte trivs särskilt bra i. För att få ut så mycket så möjligt ur processen är det därför angeläget att minska antalet reningssteg och att försöka göra, framför allt de första reningsstegen, snabba. Begränsande faktorer vid kromatografiupprening Eftersom produkten kan bli både sämre och dyrare att tillverka om reningsstegen tar lång tid strävar man hela tiden efter ökad effektivitet. För att kunna göra en separationsprocess snabbare måste man först veta vilka faktorer som är begränsande. Tidsåtgången för en upprening påverkas av mängden vätska som skall pumpas genom kolonnen, pumphastigheten och kolonnens bredd och höjd. När man väljer flödeshastighet måste man ta hänsyn till tiden provmolekylerna behöver för att tränga in i porerna och tryckmotståndet i kolonnen. Flödet från pumpen trycker fram provet i kanalerna mellan kulorna, sedan måste provet själv ta sig in i porerna. Den förflyttningen är slumpartad och kallas diffusion. Även om molekylerna rör sig ganska fort, tar det lång tid att ta sig från ett ställe till ett annat, när de lika gärna tar ett steg bakåt som framåt. Med små matriskulor behöver molekylerna inte förflytta sig så långt på detta bångstyriga vis. Tryckmotståndet beror på hur stora kanalerna är mellan gelkulorna. Har man små kulor packar de sig tätt så att kanalerna blir smala. Har man större kulor blir kanalerna större. Om man har ett högt tryckmotstånd behövs en stark pump för att kunna pumpa genom något. Dessutom måste matrisen vara robust för att tåla ett sådant tryck och inte bli söndermosad. Det finns matriser gjorda av glas, keramik eller plast som klarar höga tryck. Andra matriser, som ofta används, är gjorda av geleartade material och tål därför inte alls lika höga tryck. Ett skäl till att ändå använda de mjukare gelerna är att de är hydrofila (vattenälskande). Det innebär att provet inte märker så stor skillnad på gelen och vattnet. Andra material som antingen är hydrofoba (feta, vattenskyende) eller laddade kan binda till sig oönskade molekyler ur provet. Eluerar man sedan, kommer föroreningarna ut tillsammans med det upprenade provet och smutsar ner det. Visserligen försöker man att göra de hårda materialen mera vattenlika för att undvika detta, men vissa prov är extra känsliga och där kan man märka en tydlig effekt. Slutsatsen blir alltså att om man skall kunna använda en hög flödeshastighet skall man ha stora matriskulor för att få ett lågt tryckmotstånd och små matriskulor för att provet skall hinna tränga in i porerna. Denna paradox har personer före mig försökt lösa. En briljant lösning är att använda stora kulor med hål i, kanaler som går genom kulorna, genom vilka lite av flödet rinner. Detta gör att sträckan molekylerna behöver diffundera blir avsevärt kortare utan att tryckmotståndet över kolonnen ökar. Det finns en plastmatris som är gjord så, och inom avdelningen har man framställt en hydrofil "superporös" gel. Superporös gel För att se om den superporösa gelen kunde användas för att lösa uppgifter fortare och bättre än andra matriser, samarbetade jag med ett företag som tillverkar läkemedel, Pharmacia & Upjohn. De hade en upprening som de ville göra snabbare. De tillverkar faktor VIII, som är ett protein vi behöver för att blodet skall kunna koagulera och starta läkningsprocessen när det gått hål på ett blodkärl. Vissa blödarsjuka saknar just detta protein och behöver ta sprutor med faktor VIII för att kunna leva ett någorlunda normalt liv. Faktor VIII kan renas fram ur blod, men både risken för aids och bristen på blodgivare har uppmuntrat till att börja tillverka det med hjälp av genteknik. På Pharmacia & Upjohn har man därför satt in faktor VIII-genen i speciella hamsteräggceller, som kan odlas i en bioreaktor. Nu vill de kunna följa faktor VIII-halten i reaktorn under odlingens gång. För att kunna mäta halten måste proteinet vara mycket renare och mer koncentrerat än vad det är i reaktorn. Därför måste man ta ut ett prov och rena upp det innan man kan analysera det. Den uppreningsmetod som används i produktionen består av flera steg och tar lång tid. Ett av stegen är affinitetskromatografi, men även det tar tid. Vi jämförde därför den matris de brukar använda (A), med en superporös gel (B), och en gel som var likadan som den superporösa, fast utan superporer (C). Resultatet är beskrivet i artikel I, men kan sammanfattas med att superporerna gjorde att man kunde pumpa provet 4 gånger fortare genom kolonnen (B jämförd med C). Om man istället jämför med A blev resultaten mer svårtolkade, vilket diskuteras i artikeln. Vid elueringen användes hela tiden ett ganska lågt flöde. Då kom det upprenade provet ut mycket mera koncentrerat (i mindre vätskevolym) från kolonnen B än de båda andra. Expanderade bäddar Det finns en ny sorts kromatografi, expanderad bädd (EB), som klarar av cell- och partikelinnehållande prov. Det betyder att man kan hoppa över det första uppreningssteget (centrifugering / filtrering). För att det skall fungera måste det finnas tillräckligt stora kanaler genom kolonnen för att även cellerna skall kunna passera och tvättas ut. Ett sätt att åstadkomma det är att pumpa vätskan nerifrån och upp genom kolonnen så att kulorna lyfts upp lite. Då blir det större mellanrum mellan dem, där celler och dyl. kan passera genom. För att kulorna inte skall följa med flödet ut ur kolonnen måste de då vara ganska tunga. De skall helst inte åka omkring för mycket, så att det blir omblandning i hela kolonnen, utan bara lyfta lite grann. Det kan man åstadkomma genom att låta dem vara lite olika tunga, så att de tyngsta hela tiden vill vara längst ner, och de lättaste överst. Sådana kolonner kallas alltså expanderade bäddar, eller klassificerade fluidiserade bäddar. I en EB kolonn bildas inga höga tryck, eftersom kanalerna mellan matriskulorna är stora och kulorna är fria att röra på sig. Däremot måste kulorna vara tyngre ju högre flöde man använder, annars stannar de inte kvar i kolonnen. Det finns specialgjorda matriser för EB-kromatografi som har visat sig fungera bra, men det skulle vara bra att kunna använda ännu högre flöden. För att få gelkulorna tunga måste man antingen använda ett tungt poröst material eller kombinera ett poröst och ett tungt material. För att matrisen verkligen skall vara användbar vid riktigt höga flöden måste ju också diffusionsavstånden i den porösa delen av kulan vara korta. Vi har därför gjort en ny EB-matris som består av tunga kärnor täckta med ett tunt lager porös gel (s.k. pelikulär matris). Tillverkningsmetoden är beskriven i artikel III, där man också kan se bilder på olika varianter på kulor som vi fick fram. Jag valde ut ett par olika storleksfraktioner för att prova hur de fungerade. Det första testet var att hälla i dem i en kolonn, pumpa och se vad som hände. Det visade då sig vara viktigt att kolonnen sitter rakt (lodrätt) annars strömmar vätskan mest längs den övre kolonnväggen. Därför lät vi tillverka ett specialstativ, som kunde justeras så att kolonnen satt rakt. Nästa problem var att få flödet jämnt spritt i hela kolonnen vid inloppet. I en packad kolonn där man har ett visst tryckmotstånd sprider sig flödet automatiskt ganska jämnt, om kolonnen är bra packad. För att åstadkomma motsvarande i en expanderad bädd utan nämnvärt tryckmotstånd måste man sätta in någon sorts duschmunstycke i inloppet till kolonnen. När vi väl hade en fungerande kolonn mätte vi hur fort man kunde pumpa utan att kulorna åkte ut ur kolonnen, och hur stor omblandning vi fick i kolonnen vid de olika flödeshastigheterna. Sedan jämförde vi med en kommersiell EB-matris och resultaten andra fått i sina kolonnuppställningar. Det visade sig att den ena fraktionen klarade nästan dubbelt så högt flöde som den kommersiella matrisen och den andra fraktionen ända till 8ggr högre flöde, vilket är mycket bra. Omblandningen var låg i alla försöken, men blir högre ju fortare man pumpar. När de nya matriserna användes var omblandningen mindre än för den kommersiella vid samma betingelser. Nästa test (artikel IV) var att se om pordiffusionen var snabb nog för de höga flödena. För att mäta detta gjordes s.k. genombrottskurvor. Då pumpar man prov genom en affinitetskolonn och mäter hur mycket prov som binds in till kolonnen, och hur mycket som rinner rakt igenom. Från början binds allt in, men efterhand som det blir allt färre lediga ligander att binda till hittar inte alla provmolekyler någon av dem, och fastnar därför inte. Ju fortare man pumpar desto kortare tid har molekylerna på sig, och därför binds mindre in. Det är ofta den långsamma pordiffusionen som gör att molekylerna inte hinner hitta de lediga liganderna. När jag jämförde genombrottskurvor för den nya matrisen vid olika flöden såg de likadana ut d.v.s. provmolekylerna hittade alla lediga ligander oavsett hur fort jag pumpade. Jag gjorde samma mätningar på en kommersiell EB-matris (Streamline protein A, Amersham Pharmacia Biotech). Där märktes en tydlig skillnad mellan olika flöden d.v.s. diffusionen hann inte med (se figur 3 i artikel IV). Teorier för beskrivning av omblandningen av vätska i en expanderad bädd När man separerar olika ämnen från varandra måste man se upp så att de inte blandar sig igen innan man hinner samla upp dem. Man kan likna flödet av vätska genom en kromatografikolonn med vattnet som rinner i en bäck. I delar av bäcken där det är grunt rinner vattnet långsamt, men i djupa strömfåror forsar det fram med hög hastighet. Om det sticker upp nåt i vattnet får man en lugn fläck precis framför och virvlar på baksidan av hindret. Tävlar man med barkbåtar i en sådan bäck kommer båtarna fram olika fort beroende på vilken väg de väljer. På samma sätt kommer molekyler som valt olika väg genom en kromatografikolonn fram olika fort. Eftersom man i regel har väldigt många molekyler ser man det som att det som från början var ett smalt band kommer ut som ett brett utspätt band. När man separerar olika molekyler vill man att de skall komma ut som smala fina band, annars kan slutet på ett band gå ihop med början på nästa. För att kunna mäta och jämföra hur bra olika kolonner är, har man hittat på olika mått på omblandningen. För packade kolonner har dessa teorier och mått använts länge och är väl beprövade. Expanderade, eller fluidiserade, bäddar har använts inom andra områden, men inte så mycket för kromatografi, tidigare. När intresset nu har ökat för expanderade bäddar har man börjat använda samma teorier och mått för att mäta omblandningen i dem som man använder för packade bäddar. Eftersom många av dessa mått är beroende av saker som varierar på ett helt annat sätt i expanderade bäddar än i packade, som t.ex. kolonnhöjden och mellanrummen mellan matriskulorna, är det inte så självklart att dessa mått ger en bra beskrivning av omblandingen i de expanderade bäddarna. I artikel V går vi igenom dessa teorier och jämför med experiment för att visa vilka konsekvenser expansionen får på de olika måtten, och föreslår alternativa sätt att mäta effektiviteten för expanderade kromatografikolonner. Mätningar av proteinhalter i bioreaktorer En bra metod för att snabbt mäta hur mycket av ett visst protein man har i en komplicerad lösning, är att specifikt fånga det med hjälp av en affinitetsmatris. Alla andra sorters protein rinner då rakt igenom kolonnen. När man sedan eluerar kan man skicka en ljusstråle genom provet och se hur mycket ljus som absorberas. Ju mer protein det finns i lösningen, desto mer ljus, med en viss våglängd, absorberas. Absorbansen är alltså ett mått på hur mycket protein som finns i lösningen. När man fångat proteinet på kolonnen kan man använda andra mätmetoder också. En metod kallas flow-ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). Då låter man en enzym-märkt antikropp binda till provet, som redan sitter fast på kolonnen. Enzymet kan omvandla ett substrat, i det här fallet ett ämne som får en kraftig färg när det reagerat. Då kan man mäta absorbansen på färgämnet i stället för på proteinet, och kan på det viset mäta små mängder mer noggrant. Som en lämplig tillämpning för den nya EB-matrisen mätte vi antikroppshalten i prov från en bioreaktor (artikel IV). Proverna fick vi från ett företag, BioInvent AB, som tillverkar musantikroppar i en bioreaktor. Jag satte fast affinitetsligander (protein A, som kan fånga antikroppar) på EB-matrisen och gjorde i ordning en liten expanderad bädd kolonn (0.5 cm i diameter). Sedan analyserade vi proverna med flow-ELISA metoden. Om man jämför med liknande mätningar gjorda tidigare (med en annan matris) gick denna 4 gånger fortare och spridningen i resultaten var nästan 4 gånger mindre. Man kan alltså göra noggrannare mätningar snabbare. Superporös plugg i analyser av cellinnehållande prov En nackdel med expanderade bäddar är att man måste vara så noga med att montera dem rakt. Om de skall monteras in i en automatisk utrustning och skötas av personer som inte är vana vid att hantera dem är risken stor att de inte fungerar lika bra som i de ovan beskrivna experimenten. Vi testade därför möjligheten att byta ut den mot en superporös plugg. Det är en gelstav med kanaler genom. Dessa kanaler kan man göra stora nog för celler att kunna passera genom. Om diffusionsavståndet är den begränsande faktorn kan man förvänta sig ett sämre resultat med en superporös plugg än med en pelikulär expanderad bädd. I vissa fall är det viktigare med en robust metod än en som är optimal i andra avseende. I artikel II beskrivs hur både intra- och extracellulära ämnen (d.v.s. ämnen som finns i och utanför cellerna) kan mätas med hjälp av afffinitetskolonnener bestående av superporösa pluggar i stället för expanderade bäddar, som tidigare beskrivits. Resultaten visade att det gick bra att pumpa cellinnehållande prov genom gelpluggen. Analystiden låg mellan den för EB med kommersiell matris och den för den nya EB-matrisen. I vissa av försöken kopplades analysutrustningen direkt till en bioreaktor, och mätningar gjordes kontinuerligt under odlingens gång. För användning industriellt bör utrustningen också automatiseras. Slutsatser och framtida möjligheter De finns flera skäl till att ta fram snabbare, bättre proteinrenings- och analysmetoder. Kromatografiska reningsmetoder kan göras snabbare genom att använda nya bättre matriser. För att kunna avgöra vilka matriser som är bäst är det också viktigt med bra utvärderingsmetoder. Flera analysmetoder använder sig av kromatografi i någon form, och kan därmed också förbättras med hjälp av dessa nya matriser. Efterhand som expanderade bäddarna för EB-kromatografi kan göras stabilare och effektivare blir denna kromatografi variant alltmer attraktiv att använda i det första reningssteget för upprening av partikel- eller cellinnehållande prov. Särskilt attraktivt är det för analyser där man vill kunna automatisera hela analysproceduren. En utförligare jämförelse mellan olika typer av superporösa pluggar och expanderade bäddar bör göras för att se vilken av metoderna som lämpar sig bäst för olika ändamål. En automatiserad analysuppställning med möjlighet till att inte enbart mäta mängden av ett visst protein utan också andelen delvis felaktiga proteinmolekyler håller på att tas fram.