Growth factor regulation of the urokinase plasminogen activator (uPA) system in human endometrium, and the significance of uPA receptor activation in endometrial angiogenesis

Abstract: Popular Abstract in Swedish Avhandlingen studerar tillväxtfaktorernas reglering av uPA-systemet i endometriet, och betydelsen av uPA-receptorns (uPAR) aktivering i den endometriella angiogenesen. Tillväxtfaktorer är polypeptider, vilka fungerar som signalmolekyler i cellernas kommunikation. Tillväxtfaktorerna frisätts från sina ursprungsceller och binder sig till specifika receptorer på ytan av celler av samma typ (autokrin signalering) eller till andra sorters celler (parakrin signalering). De flesta tillväxtfaktorer har fått namn efter biologisk källa eller efter biologisk aktivitet. Plasminogenaktiverings (PA)-systemet reglerar omvandlingen av plasminogen till plasmin. Plasminogen aktiveras till plasmin av någon av plasminogenaktivatorerna uPA eller tPA. Aktivatorerna uPA och tPA hämmas av de specifika hämmarna PAI (Plasminogen Activator Inhibitor)-1, och PAI-2. Plasmin är ett proteolytiskt enzym, dvs det bryter ned vissa proteiner. Till dessa hör fibrin som utgör en del av stommen i de flesta typer av vävnader. Plasmin har därigenom en avgörande roll i nedbrytningen av den vävnad, extracellular matrix (ECM), som omger cellerna. Nedbrytning sker vid situationer som tillväxt av vävnad, tumörtillväxt och metastasering samt kärlnybildning-angiogenes. Transforming growth factor -beta (TGF-beta) är en tillväxtfaktor som har visat sig hämma tillväxten av många celltyper, samtidigt stimulerar den tillväxten av vissa maligna cellinjer, varav en från endometriet. TGF-betas finns i 5 olika former varav TGFB1-3 hos människan. TGF-betas är involverade i differentiering av ett flertal vävnader genom att stimulera produktion av proteiner i ECM. TGF-betas frisätts i en latent form, och en av de faktorer som krävs för att aktivera TGF-beta är plasmin. TGF-beta mRNA har identifierats i endometriets epitelceller och stromaceller under hela menstruationscykeln. Epidermal growth factor (EGF) är ett starkt mitogen (stimulerar celldelning) för många typer av celler, bland annat epitelceller och endotelceller. EGF binder sig till sin receptor (EGFR), vilken går igenom cellmembranet. När en bindning av EGF till den extracellulära delen av EGFR sker, blir receptorn aktiverad och därigenom startar en kaskad av enzymatiska processer intracellulärt. Dessa förmedlar den biologiska aktiviteten hos cellen i fråga, t.ex celldelning. EGF finns i endometriet, under hela menstruationscykeln i både epitel- och stromaceller. Livmoderslemhinnan -endometriet- tillväxer snabbt under inverkan av hormonet estrogen. Under denna fas av menstruationscykeln, vilken benäms proliferationsfas är PA-aktiviteten hög, medan den i sekretionsfasen är låg, för att förbereda endometriet för graviditet. I sekretionsfasen dominerar hormonet progesteron. Hämmaren PAI-1 finns i ökad koncentration i sekretionsfasen, och dess reglering är avgörande för balansen av den endometriella proteolysen. I endometriet finns flera olika tillväxtfaktorer vilka har visats ha betydelse för uPA-systemet och dess hämmare i andra typer av celler/vävnader. I denna avhandling har vi undersökt betydelsen av framförallt EGF och TGF-beta i relation till uPA-systemet, i den regelbundet återkommande kärlnybildningen i livmoderslemhinnan – den endometriella angiogenesen. Detta är den enda, hitintills kända, kärlnybildningen hos den vuxna individen som inte orsakas av sjukdomar eller skador. Avhandlingen består av fyra vetenskapliga uppsatser, I-IV, här redogöres för resultaten i korthet. I arbete nummer I fann vi att både tillväxtfaktorer och progesteron ökar koncentrationen av PAI-1, dock via olika mekanismer. Denna observation, att ett hormon och ett flertal tillväxtfaktorer är involverade i regleringen av PAI-1, indikerar betydelsen av PAI-1 i endometriets biologi. Vi undersökte i arbete II endometriets uttryck av TGF-beta1 i de olika faserna av menstruationscykeln, samt TGF-beta1:s reglering av PA-systemet i odlade endometriella stromaceller. Vi fann att stimulering av stromaceller med såväl TGF-beta1 som med progesteron ökade koncentrationen av PAI-1, medan endast TGF-beta1 ökade koncentrationen av uPA. Höga koncentrationer av både uPA och PAI-1 ger förutsättning för bildning av komplexet uPA:PAI-1. I delarbete III påvisade vi detta genom att med ELISA-teknik bestämma koncentrationen av uPA:PAI-1 komplexet frisatt från stromaceller stimulerade med TGF-beta1. Eftersom en ökning av ett extracellulärt komplex mellan uPA och PAI-1 kan påverka intilliggande celler in vivo, undersökte vi även effekterna av såväl uPA, PAI-1 samt uPA:PAI-1 komplexet på migration av endotelceller. Såväl uPA:PAI-1-komplexet som uPA ensamt ökade endotelcellsmigrationen mätt med ett “wound-test”. PAI-1 däremot påverkade inte migrationen. Att uPA såväl ensamt som i komplex med PAI-1 ökar migrationen likvärdigt visade att den proteolytiska aktiviteten hos uPA inte är nödvändig för denna effekt. Att däremot en bindning av uPA respektive uPA:PAI-1 komplexet till uPAR krävs, visade vi genom att förhindra bindningen med hjälp av antikroppar. Detta hämmade den stimulatoriska effekten av både uPA och uPA:PAI-1 komplexet. Bitar från endometrievävnad (explants) har visat sig stimulera kärlnybildning i andra sammanhang. Med utgångspunkt från detta antar vi att endometrieceller frisätter en angiogen signal, och i vårt sista delarbete, IV, har vi kvantiterat och karakteriserat denna signal. Vi visade att explants från vävnad tagen i tidig/mid proliferativ fas samt från mid/sen sekretionsfas frisätter en kemotaktisk signal som är starkare än den från vävnad i midcykelfas. Vi studerade hur explants påverkade migrationen av endotelceller i närvaro av antikroppar mot EGF, VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) samt bFGF (basic Fibroblast Growth Factor). Vi fann att ungefär 70% av den kemotaktiska signalen blockerades med antikroppar mot såväl uPA-receptorn (uPAR) som mot EGF, var och en för sig eller tillsammans. Vi fann också att EGF ökade uttrycket av uPAR, samt stimulerade migration av endotelceller. Denna migration kunde blockeras med antikroppar mot uPAR. Med dessa observationer visar vi att EGF är en stark angiogen signal i endometriet, och att en interaktion med uPAR är viktig för den endometriella angiogenesen.