Hormone-Sensitive Lipase and Protein Kinase B; Molecular characterization in testis, adipose tissue and pancreatic beta cells

Abstract: Popular Abstract in Swedish Min avhandling är en s.k. sammanläggningsavhandling och innehåller fyra delarbeten (I-IV), vilka alla är publicerade i vetenskapliga tidskrifter. I delarbetena redovisas undersökningar av två enzymer, hormonkänsligt lipas (HKL) och proteinkinas B (PKB). HKL är ett sedan länge välkänt enzym, vars huvudsakliga uppgift är att spjälka fett (triglycerider) som lagras i fettceller (adipocyter). Bland lipaser är HKL unikt på flera sätt, t.ex. spjälkar det kolesterolestrar, en lagringsform för kolesterol, lika effektivt som det spjälkar triglycerider. Unikt bland lipaser är också att dess aktivitet är reglerad med hjälp av signalmolekyler från andra organ i kroppen, bl.a. det sympatiska nervsystemet. HKL upptäcktes på 1960-talet i fettväv från däggdjur och har sedan dess ingående karakteriserats. PKB däremot, är ett enzym som upptäckts på 1990-talet och dess egenskaper och funktion är bara delvis kända. Ett proteinkinas är ett enzym som ofta deltar i signalöverföringsreaktioner (signaltransduktion) i celler och som har förmåga att reglera aktiviteten hos andra proteiner genom att till dessa överföra en fosfatgrupp. PKB hittades först i ett tumörframkallande virus men sedermera också i djur och människor och det verkar nu som om det finns i de flesta sorters celler hos däggdjur. Man har iakttagit dess medverkan i en mängd olika aktiviteter i cellen, såsom t.ex. energiomsättning och celltillväxt. Våra undersökningar av HKL och PKB har syftat till att med cell- och molekylär-biologiska metoder påvisa deras förekomst och klarlägga en del av deras egenskaper i några däggdjursvävnader där de tidigare varit antingen ofullständigt kända eller helt okända. Således har vi studerat HKL i testikel (delarbetena I och II) och PKB i fettväv (delarbete III) samt i de insulinproducerande beta-cellerna i pankreas (bukspottkörteln) (delarbete IV). HKL har i fettväven en viktig, och i vissa situationer livsavgörande, funktion. Överskott av energisubstrat vid rikligt födointag lagras på ett för kroppen ekonomiskt sätt i form av triglycerider i adipocyter. Energi för vardagliga aktiviteter får vi huvudsakligen via nedbrytning av näringsämnen från födan och i viss mån från lagrade kolhydrater (sockerarter). Kolhydratlagret blir emellertid relativt snabbt utarmat, t.ex. under nattens fasta och vid långvarig kroppsansträngning, eller ännu mer uttalat, vid svälttillstånd. Signalmolekyler, särskilt s.k. katekolaminer (t.ex. adrenalin) i kroppen stimulerar då adipocyter till nedbrytning av det lagrade fettet (lipolys). Via en kedjereaktion av signaltransduktionsmolekyler i adipocyterna aktiveras HKL och frigjorda fettsyror kan sedan användas för energiproduktion i t.ex. muskler. Den signalkedja som leder till lipolys är väl karakteriserad. En viktig molekyl i denna är cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) (Fig. 2, sid. 14). HKL:s aktivitet motverkas av insulin, som utsöndras från b-celler vid födointag. Insulin är mest känt för att reglera kolhydrat- (glukos-) nivåerna i blodet men reglerar också fett-omsättningen, bl.a. just genom att blockera spjälkningen av lagrade triglycerider. Denna s.k. anti-lipolytiska effekt utövar insulin genom att initiera en annan signaltransduktionsväg i fettcellen. Till skillnad från den lipolytiska signalkedjan är den anti-lipolytiska inte fullständigt känd. Man vet att genom en kedjereaktion av fosforyleringar aktiveras ett fosfodiesteras (PDE3B), ett enzym som bryter ner cAMP och därmed blockerar den lipolytiska signalvägen (se Fig. 2, sid. 14). Man vet också att det proteinkinas som fosforylerar och aktiverar PDE3B är ett s.k. serinkinas, men man har ännu inte isolerat och fastställt identiteten på detta kinas. Enzymer är i de flesta fall proteiner, eller utryckt på ett annat sätt, en del av alla proteiner som finns har enzymatisk aktivitet. Dessa kan studeras på olika sätt: dels kan enzymaktiviteten mätas i s.k. enzym-assays, dels kan proteinet synliggöras. En känslig metod för det senare inbegriper användning av antikroppar som specifikt känner igen ett givet protein. Det är också vanligt att man synliggör det budbärar-RNA (mRNA) som kodar för proteinet ifråga; detta gör man antingen med s.k. cDNA (complementary DNA) eller med s.k. oligonukleotider, båda med förmåga att leta upp och specifikt binda till ett givet mRNA i vävnadspreparat eller i cellextrakt. Dessa metoder är centrala i samtliga delarbeten. De två första delarbetena i avhandlingen behandlar HKL i testikel. Vid karakteriseringen av HKL i fettväv hade man i vår forskargrupp observerat att HKL finns, om än i mindre mängder, även i vävnader som binjurar, äggstockar och testiklar. Det framgick då att HKL i testikel, till skillnad från det i binjurar och äggstockar, var avsevärt större än fettvävs-HKL. Andra forskargrupper hade vid undersökningar av ett s.k. kolesterolesteras i testikel funnit att detta hade egenskaper som påminde om HKL:s egenskaper. I delarbete I var de främsta syftena att undersöka om testikel-HKL hos råtta var identiskt med det nämnda kolesterolesteraset och att fastställa i vilka testikelceller som HKL finns. Vi fann att HKL är ett av flera kolesterolesteraser i testikel och att det under råttans utveckling uppträder först då spermier börjar produceras, dvs i puberteten. Vid denna tidpunkt förflyttas testiklarna från bukhålan till pungen, där en för spermiebildning gynnsam temperatur (32-33°C) råder. (Hos människa sker denna nedvandring av testiklarna normalt före födseln). Vi ville därför undersöka om punglokalisation är avgörande för produktion av HKL. Vid jämförelser med testiklar belägna i bukhålan (s.k. kryptorkism) var det uppenbart att HKL här inaktiverades och upphörde att produceras. Med in situ-hybridiseringsteknik, som möjliggör påvisande av mRNA i vävnadssnitt, kunde vi visa att HKL förekommer i anslutning till de mognande könscellerna i testikel. Däremot kunde vi inte påvisa HKL i hormonproducerande, s.k. Leydigceller. Dessa resultat tydde på att HKL, snarare än att medverka i hormonproduktion, vilket tidigare hade föreslagits, är av betydelse för spermiernas utveckling. Syftena i delarbete II var dels att fortsätta att studera testikel-HKL:s cellulära lokalisation, nu med en antikroppsbaserad s.k. immunhistokemisk teknik, dels att klona cDNA för HKL från testikel för att genom att fastställa dess DNA-sekvens klarlägga vari storleksskillnaden gentemot fettvävs-HKL består. De immunhistokemiska undersökningarna bekräftade våra tidigare iakttagelser och visade att HKL huvudsakligen uppträder i könsceller under deras utmognad till spermier. Kloningen resulterade i att vi kunde fastställa förekomsten av en testikel-specifik del, en s.k. N-terminal domän (se Fig. 9 sid 54). Vid detaljstudier av genen för humant HKL fann vi i en tidigare okänd region av genen ett nytt s.k. exon, dvs ett DNA-avsnitt som kodar för den testikel-specifika domänen. HKL i testikel utgör sålunda en ny isoform som vi kallar HKLtes, vars egenskaper, funktion och betydelse för spermieutvecklingen ännu inte är klarlagda. De två följande delarbetena behandlar PKB och dess reglering i adipocyter och i beta-celler. Då arbetet inleddes hade andra forskargrupper visat att PKB kunde fosforyleras och aktiveras i celler som stimulerades med insulin. Dessa fynd, tillsammans med inledande karakterisering från vår egen forskargrupp rörande det serinkinas som fosforylerar och aktiverar PDE3B i adipocyter, gjorde det intressant att studera om PKB kunde fungera som PDE3B-kinas. Att utreda detta är dock ett arbete på sikt och delarbetena nedan får betraktas som inledande studier. Delarbete III ägnas åt studier av PKB i adipocyter från råtta. Syftet var att karakterisera PKB i adipocyter och studera hur det regleras av insulin i dessa celler. Sådana studier skulle lägga grunden för vår förmåga att senare uttala oss om dess relevans som ett PDE3B-kinas. För att kunna mäta aktiviteten av PKB i extrakt från adipocyter utarbetade vi en s.k. kinas-assay som var selektivt användbar för just PKB. Med hjälp av denna metod och med PKB-specifika antikroppar kunde vi visa att insulinstimulering av isolerade adipocyter leder till snabb aktivering av PKB och att aktiveringen är beroende av fosforylering av PKB-proteinet. Dessutom innefattar aktiveringen en förflyttning (translokering) av PKB från cellens inre till insidan av det omgivande cellmembranet. För att kunna påvisa translokeringen använde vi en kemisk substans, peroxovanadat, som är en ofta använd substans för att åstadkomma insulinlika effekter i celler. Våra resultat överensstämmer med den hypotes som dominerar vad gäller mekanismerna för hur PKB regleras. De nya fynden i detta arbete var dels sättet att mäta PKB:s aktivitet i en komplex lösning som ett cellextrakt, dels translokeringen av PKB, vilken tidigare hade föreslagits äga rum men inte direkt demonstrerats i en naturlig cell. I delarbete IV visar vi att PKB förekommer även i de insulinproducerande beta-cellerna i pankreas från råtta och mus. Detta var tidigare okänt, men andra forskargrupper har visat att signaltransduktion som involverar cAMP och PDE3B äger rum i sådana celler och att denna kan leda till en hämmad utsöndring av insulin. Vi demonstrerar i detta arbete att mRNA och protein motsvarande tre olika isoformer av PKB förekommer, både i beta-celler från Langerhanska öar och i beta-cellinjer, dvs beta-celler som är tumöromvandlade och därmed går att hålla i cellkultur under lång tid. Vi visar också att stimulering av beta-cellinjer med insulinlik tillväxtfaktor I (IGF-I) leder till fosforylering och aktivering av PKB. Vi kan emellertid än så länge bara spekulera kring betydelsen av PKB för beta-cellens funktion och för insulinutsöndringen. Det är tänkbart att PKB här deltar i signaltransduktion som leder till minskade cAMP-nivåer och att denna bidrar till att hämma insulinutsöndringen.