Structure-function relationships of hormone-sensitive lipase

Abstract: Popular Abstract in Swedish Kroppens fettceller innehåller en energidepå i form av s.k. triglycerider, en glycerolmolekyl med tre påkopplade fettsyror, som kan användas vid behov (fasta, arbete och dylikt). För att kroppens andra celler ska kunna använda fettdepåerna som energikälla, måste fettsyrorna frikopplas från glycerolmolekylen och skickas ut ur fettcellerna till blodet. Fettsyrorna transporteras sedan till andra organ och celler. Spjälkningen av fettsyrorna från triglyceriderna sker i tre steg (en fettsyra i taget) och katalyseras av två enzym i samarbete. De första två hydrolytiska reaktionerna katalyseras av hormon-känsligt lipas (HSL), medan den sista hydrolysen katalyseras av monoglyceridlipas. Eftersom den första hydrolysreaktionen är den långsammaste är denna den hastighetsbegränsande för den lipolytiska reaktionen. HSL är därför det fysiologiskt viktigaste enzymet vid kontroll av fettsyrafrisättningen från fettceller. Denna process styrs noggrant av kroppen, så att en bra balans mellan förbrukning av fettsyror i andra celler och frisättning från fettcellerna bibehålls. Fettcellernas fettsyra-frisättning styrs med hjälp av hormoner och nervös signallering. En mycket väsentlig del av denna kontroll styr HSL:s aktivitet. Signaleringen av hormoner styr till vilken grad HSL blir fosforylerad (fosfat påkopplas på specifika ställen), vilket i sin tur styr HSL:s fömåga att hydrolysera triglyceriderna. Det är också viktigt att HSL innehåller ställen som känner igen triglyceriddepån i fettcellerna, så att HSL kan utföra sitt katalytiska arbete. Dessa två egenskaper är förmodligen unika för HSL i jämförelse med andra lipaser. HSL har troligen också egenskaper som är gemensamma för lipaser, eftersom de katalyserer likadana reaktioner. Det har visats att olika lipaser i sin tredimension-ella struktur är veckade på samma sätt (hydrolasveckning). Dessutom utför dessa lipaser sina katalytiska reaktioner med hjälp av framför allt tre aminosyror (en serin, en aspartat eller glutamat och en histidin), vilka tillsammans kallas katalytisk triad. HSL:s viktiga roll i kroppens energiomsättning, gör det till ett intressant målenzym för utvecklingen av nya läkemedel. Vid risk för åderförfettning och hjärt-kärl sjukdomar, på grund av höga fetthalter i blodet, kan sådana läkemedel ha botande effekt. För att kunna utveckla läkemedel riktade mot HSL och för att i detalj kunna beskriva dess roll i kroppen, är det viktigt att fysiskt karaktärisera detta enzym. Det arbete som har utförts i denna avhandling har tillsammans med andra undersökningar fått fram uppgifter om HSL:s olika egenskaper och deras lokalisering på HSL-molekylen. En stor del av forskningsarbetet har krävt stora mängder rent HSL. Med hjälp av modern genteknologi har vi lyckats få speciella insektceller i kultur att framställa stora mängder HSL, som vi sedan renat fram [II]. För att veta om detta s.k. rekombinanta HSL protein är jämförbart med det protein som finns i fettcellerna, har vi jämfört med protein renat från fettceller och mätt aktivitet och reglering. Denna jämförelse avslöjade inga skillnader mellan de två HSL-preparation-erna, och rekombinant HSL är därför en utmärkt källa för vidare undersökningar av HSL:s egenskaper [II]. Genom att jämföra HSL med andra lipaser klargjordes vilka delar som utgör den för lipaser gemensamma hydrolasveckning [II]. I ett annat arbete gjordes en tredimensionell modell av HSL:s hydrolasveckning och det framgick vilka aminosyror som utgör den katalytiska triaden. När dessa aminosyror ändras, förloras HSL:s katalytiska egenskaper och detta tyder på att dessa aminosyror utgör den katalytiska triaden [I, III]. HSL :s hydrolasveckningen utgör bara en del av hela proteinet. En del som kan tänkas höra ihop med hydrolasdelen innehåller de aminosyror som kan fosforyleras, och därför antas denna delen mediera regleringen av HSL:s aktivitet [II]. Den resterande delen av HSL kan tänkas utgöra en egen tredimensionellt veckad del (domän). Möligheten att HSL utgörs av mer än en domän, undersöktes genom att denaturera och klyva HSL (med s.k. proteaser) under samtidig mätning av dess aktivitet [II]. Dessutom mättes ändringar i HSL:s fysiska tillstånd under denaturering [IV]. Dessa analyser stöder att HSL har två fysiska domäner. Analys av HSL:s fördelning av hydrofila delar har tillsammans med klyvning av HSL, avslöjat att den aktivitetsreglerande delen är exponerad för omgivningen [IV]. Detta är också förväntat av den proteindel som fungerar som mål för andra enzymer, i detta fall enzymer som som sätter på fosfat (kinaser) och som plockar bort fosfat (fosfataser). Samma analyser visar också att det finns en liten del i HSL som binder ihop två stora delar som är tredimensionellt veckade oberoende av varandra [IV]. Denna del är också exponerad för omgivningen. Bilden på HSL är nu att det finns två fysiska domäner förbundna med en kort länk. Den ena domänen är till stor del veckad som andra lipaser och innehåller den katalytiska förmågan, vilket bekräftas av identifieringen av de för aktiviteten så viktiga aminosyrorna. En annan del av denna domän är förmodligen viktig för regleringen av HSL:s aktivitet. Vilken roll den andra domänen spelar är inte klarlagt, men det kan tänkas att en del av förmågan att känna igen triglyceriddepån är lokaliserad till denna domän.