Development and Characterization of a Global Brain Ischemia Model in the Mouse -A Genetic and Pharmacological Approach

Abstract: Popular Abstract in Swedish Hjärnskador som uppstår till följd av otillräckligt blodflöde (ischemi) drabbar årligen ett stort antal människor i Sverige och leder antingen till död eller invaliditet och åsamkar stort lidande för den drabbade och dennes anhöriga. Den vanligaste orsaken till hjärnischemi är stroke (slaganfall), som beror på en propp i ett blodkärl eller en hjärnblödning, till en begränsad del av hjärnan. Denna typ av skada kan efterliknas i experimentella djurförsök genom att stänga av ett blodkärl till hjärnan (fokal ischemi). Om inte tillförseln av syre och glukos kommer igång inom en viss tid riskerar den drabbade hjärnvävnaden att förstöras. Nervceller är extremt känsliga för brist på syre och glukos, som bland annat beror på deras höga metabolism och knappa energireserver, vilket gör dem speciellt känsliga för brist på blodtillförsel. En annan typ av hjärnskada är den som uppkommer efter en kortare tids övergående ischemi till hela hjärnan som tex vid hjärtstillestånd (global ischemi). Denna typ av skada drabbar speciella områden i hjärnan som är extra känsliga, tex hippokampus där det tar flera dagar för skadan att utvecklas. Den här försenade nervcellsdöden är intressant och klinskt relevant eftersom det ger möjlighet att terapeutiskt behandla och rädda nervcellerna innan de dör. Skador i hippokampus kan få svåra följder då denna struktur är viktig för inlärning och minne. Trots omfattande forskning, där djurmodeller framgångsrikt använts för att utröna skademekanismer efter hjärnischemi, finns för närvarande inget nervskyddande läkemedel till patienter med ischemisk hjärnskada. Flera substanser, som visat sig effektiva i djurmodeller, har inte fungerat på människa i kliniska prövningar. Anledningen till denna uteblivna effekt kan vara att viktiga skademekanismer inte upptäckts. Nervcellsdöden efter upphävt blodflöde har visat sig förorsakas av inbyggda mekanismer i cellerna, sk genetiska program, som reglerar celldöden (apoptos). Endogena skyddsmekanismer aktiveras även för att skydda nervcellerna. I möss har gentekniken gjort det möjligt att slå ut enskilda gener eller förstärka deras uttryck, så att mer av genens protein produceras. Detta har gett nya möjligheter att studera vilka inbyggda mekanismer i cellerna som är viktiga för nervcellsdöden. Möjligheten att använda genmodifierade möss för att utröna den selektiva skadan efter upphävt blodflöde till hela hjärnan har varit begränsad. Anledningen är att inga reproducerbara modeller för global hjärnischemi på mus har varit tillgängliga på grund av mössens extrema känslighet, som resulterat i att djuren antingen dött eller inte fått någon reproducerbar skada. Syftet med den här avhandlingen var att sätta upp en global hjärnischemimodell för möss och karaktärisera denna med redan kända mekanismer och att försöka kartlägga nya viktiga skadevägar i den ischemiska celldöden. I det första delarbetet beskrivs utformningen av modellen, som använts för att studera global hjärnischemi i mus. I modellen användes 12 minuters avstängning av de båda halsartärerna under halothananestesi och respiration med ventilator, där andningen kontrollerades med direktmätning av koldioxiden i utandningssluften. Hjärntemperatur och kroppstemperatur kontrollerades under experimentet och en uppvärmd kuvös användes det första dygnet för att få reproducerbara skador och låg mortalitet. Även monitorering av blodflödet i hjärnbarken på båda hjärnhalvorna med hjälp av laser Doppler var viktigt för att kunna se om respektive hjärnhalva hade fått tillräckligt lågt blodflöde (<10% av normalt blodflöde) vid avstängning. De hjärnhalvor med blodflöde under 10% uppvisade skador i olika hjärnregioner, däribland hippokampus, vilket också korrelerade med avsaknad av ett blodkärl som försörjer respektive hjärnhemisfär med blod från artärerna i nackkotpelaren. Låg kroppstemperatur (hypotermi) under ischemi är känd som den mest skyddande behandlingen för att minska nervcellsskada och gav även i denna modell, då kroppstemperaturen sänktes till 33?C, ett robust skydd. Den ischemiska skadeprocessen börjar med inflöde av kalcium till nervcellerna och leder till celldöd om ischemin får fortgå. Transmittorsubstansen glutamat frisätts under hjärnischemi och aktiverar NMDA-receptorn, vilket ökar kalciuminflödet. En substans som blockerar denna receptor användes, vilket också visade sig lindra hjärnskadorna efter ischemi i vår musmodell om denna drog gavs direkt efter försöket. Proteinstress anses vara en betydande komponent i den ischemiska celldöden, vilket leder till att proteiners funktion inte kan upprätthållas. I det andra delarbetet undersöktes ett protein, heat shock protein 70 (Hsp70), som uttrycktes efter ischemi och som har till uppgift att skydda proteiner mot stress. Eftersom Hsp70 har föreslagits vara skyddande för nervceller användes en musstam som överuttryckte Hsp70 och proteinet fanns således tillgängligt i stora mängder även under ischemiförsöket. Vid försöken konstaterades inget ytterligare skydd i dessa Hsp70 överuttryckande djur jämfört med normala möss. Resultaten antyder att Hsp70 inte har någon avgörande roll för nervcellsskydd efter global hjärnischemi. Adenosin är en inhibitorisk neuromodulator i hjärnan, där adenosin bla signalerar via adenosine A1-receptorn. Aktivering av denna receptor minskar signaleringen mellan nervceller och därmed frisättningen av glutamat och det farliga kalciuminflödet till nervcellerna. Vid hjärnischemi ökar koncentrationen av adenosin och anses minska ischemisk hjärnskadan, vilket vi studerade i det tredje delarbetet. Den skyddande effekten av adenosin i hjärnan under ischemi genom dess signalering via A1-receptorn bekräftades i försök där farmakologisk inhibition av receptorn ökade skadan efter global hjärnischemi. Däremot, och möjligen ännu mer intressant, sågs ingen skillnad i skada hos möss med genetiskt utslagen A1-receptor, vilket även bekräftades i en ischemisk in vitro modell med vävnadskulturer av hippokampus. Dessa fynd tyder på att andra kompensatoriska mekanismer har aktiverats i möss med utslagen A1-receptor. Identifiering av dessa kompensatoriska mekanismer kan ge ledtrådar om skyddande komponenter efter ischemisk hjärnskada. Det stora inflödet av kalcium under ischemin aktiverar proteaser, som bryter ner olika proteiner, såsom enzym och strukturproteiner, i och utanför cellen. Endogena inhibitorer till dessa proteaser är viktiga för att upprätthålla balans i nedbrytning av proteiner. Cystatin C är en sådan proteasinhibitor som inhiberar lysosomala enzymer, vilka tros läcka ut under ischemin. Därmed torde närvaron av cystatin C vara skyddande, vilket vi ville studera i det fjärde delarbetet. Cystatin C har även immunomudulatorisk funktion och är dessutom lokaliserat till proteinaggregat i Alzheimer´s sjukdom, vilket tyder på flera olika funktioner för cystatin C. Möss med en utslagen gen för cystatin C undersöktes. Vid ischemisk stroke, fokal ischemia, konstaterades att infarkten var större hos möss med avsaknad av cystatin C, orsaken härtill torde vara aktivering av proteaser. I motsats till vår hypotes visade sig skadebilden vara den omvända efter global ischemi, där de möss som inte hade något cystatin C var mindre skadade. Detta indikerar att olika skademekanimer i de båda hjärnischemimodellerna är mer eller mindre betydelsefulla. Denna avhandling beskriver sålunda en pålitlig modell av global hjärnsichemi i mus och dess användbarhet i olika genmodifierade musstammar. Den visar att kompensatoriska mekanismer kan induceras i genmodifierade möss, hos vilka en gen slagits ut. Avhandlingen visar även att olika skademekanismer är involverade efter global och fokal ischemisk hjärnskada.