Combined structural methods to characterize an oligomeric small heat shock protein Hsp21

Abstract: Undersökning av Hsp21 med korslänknings-masspektrometriMänniskans kropp består av ungefär 30 trillioner celler och varje cell innehåller omkring 100 000 proteiner. Föreställ dig om kroppen vore jordklotet, varje vävnad ett land och varje cell en stad. Varje stad vore då konstant som Paris i rusningstrafiken. Trafiken vore helt galen hela tiden och väldigt känslig för även den minsta störning. Cellens proteiner (=bilarna) är extremt viktiga för cellens funktion och de måste vara korrekt veckade för att fungera. Felveckade proteiner kommer att störa hela systemet och bidra till aggregatbildning (=stora bilolyckor), som också är orsaken till många olika sjukdomar som Alzheimers och Huntingons. Därför är det viktigt med en bra infrastruktur och regleringssystem i cellerna, precis som i riktiga städer. Proteinet jag har undersökt i denna avhandling heter Hsp21. Man kan säga att Hsp21 är en av de viktigaste bilmekanikerna i plantornas celler.Hsp21 är ett protein som tillhör familjen chaperoneproteiner. Namnet chaperoneprotein återspeglar deras syfte: De agerar förkläde till andra proteiner, dvs. ser efter andra proteiner och ser till att de inte deltar i oönskad interaktion och bidrar till problem. Hsp står för ”Heat shock protein” eller värmeshockprotein. Proteinets minsta enhet är 21 kilodalton (Dalton är en standardenhet för att indikera massa på molekylskala) så därför kallas proteinet for Hsp21. Proteinet kommer från plantan Arabidopsis thaliana, eller backtrav och finns i plantans kloroplast. Precis som i plantor så finns det chaperonproteiner i de humana cellerna. Plantor innehåller generellt sett mycket chaperonproteiner eftersom de, olikt de flesta andra levande skapelser, inte kan flytta sig för att undvika stress från starkt ljus och höga temperaturer. Det finns många olika sätt som Hsp21 samt andra chaperonproteiner har blivit undersökta på för se hur de skyddar andra proteiner. Vi kan dela in metoderna i två olika kategorier: in vivo (”i det levande”) och in vitro (”i glas”) metoder. In vivo metoderna används inom själva plantan medan in vitro mätningarna görs i provrör. Jag har mest fokuserat på provrörsmetoder. Small heat shock proteiner är besvärliga att undersöka eftersom de verkar snabbt och under mycket kort tid. Därför tyckte vi att det vore att föredra att hitta en metod där man kunde ”frysa ögonblicket”. Detta leder till min huvudmetod: Korslänkningsmasspektrometri. Vi kan säga att korslänkern är en sorts ”lim” som limmar ihop proteiner som kommer nära varandra. Den kan också limma ihop olika delar av ett och samma protein. Först limmar jag ihop proteinerna och sen adderar jag ett enzymet trypsin. Det uppför sig som sax och klipper isär proteinerna i mindre bitar som kallas för peptider. Både trypsinet och korslänkern är väldigt specifika och klipper och limmar bara vid särskilda aminosyror. Detta genererar väldigt speciella peptider som man kan analysera med en masspektrometer. En masspektrometer är ett instrument som kan mäta storleken på peptiderna på ett väldigt noggrant sätt genom att ta tiden på hur lång tid det tar för peptiderna att flyga en viss sträcka. Denna metod är väldig noggrann och känslig. Genom att addera korslänkern och sen analysera vilka peptider har limmats ihop kan vi få information om hur proteiner interagerar och deras struktur ser ut. Det har varit en utmaning att analysera resultaten från masspektrometern eftersom blandingen av peptider i ett prov där proteiner har blivit hopklistrade är väldigt komplex samt att ju bättre instrumenten blir desto fler peptider detekterar de och desto större utmaning blir det att analysera resultaten.Med denna metod har jag kunnat presentera nya detaljer i Hsp21 strukturen. Jag har också identifierat vilka delar av Hsp21 som interagerar med och skyddar viktiga proteiner som är känsliga för stress. Dessutom har jag mätt hur Hsp21 oväntat dyker in i kloroplastmembranet under värmestress.Med detta arbete har vi fått ny information om hur Hsp21 fungerar, ett viktigt chaperon i celler på gröna plantor. Under denna process har vi också utvecklat och använt metoder för kemisk korslänknings-dataanalys, som gör det möjligt att snabbt kunna analysera andra chaperoner och proteiner.