Dynamics of Ca2 handling in vascular smooth muscle

Abstract: Popular Abstract in Swedish Glatt muskulatur är nödvändig för funktionen hos de flesta inre organ såsom blodkärl, tarmar, gallblåsa, livmoder, urin och luftvägar. I artärer bildar glatta muskelceller ett cirkulärt lager, som skiljs från blodet genom ett tunt endotelcellslager. Muskelns främsta uppgift är att kontrollera blodkärlens diameter, och därmed blodflödet till de vävnader som de försörjer. Detta är också grundläggande för bibehållandet och regleringen av blodtrycket. Blodkärlen styrs både av lokala och centrala mekanismer. Faktorer från omkringliggande vävnader, från blodbanan, endotelceller, nervändar i kärlväggen, och fysikaliska faktorer såsom blodtryck, flödeshastighet och gastryck bestämmer kärlens kontraktionsgrad. En av de främsta kontrollvägarna för muskelkontraktion går via intracellulärt kalcium, som indirekt aktiverar de kontraktila filamenten. Koncentrationen av kalcium är i vanliga fall 10.000 gånger lägre inuti celler än utanför, men den kan stiga mycket och snabbt i samband med aktivering. Kalcium kan strömma in både från det extracellulära rummet och från förråd inuti cellen, där jonen också förekommer i höga koncentrationer. Det finns jonpumpar som upprätthåller denna ojämna fördelning, och en mängd olika kanaler styr inflödet av kalcium. Till skillnad från många andra vävnader har glatt muskulatur förmågan att ändra sina egenskaper som svar på förändringar i sin omgivning. Detta är av stor fysiologisk betydelse, men kan även bidra till vissa sjukdomsförlopp. Bland annat kan den ökning i belastning som ett förhöjt blodtryck innebär, medföra att muskelceller i blodkärlsväggen omorganiserar sig, eller ökar i massa. Detta syftar till att motstå en ökad väggspänning, men kan också bidra till att det förhöjda trycket bibehålls. Vid åderförkalkning / atheroskleros sker en ännu mer drastisk förändring i kärlväggen. Som svar på endotelskada eller inflammation i kärlet kommer glatta muskelceller att dela sig, migrera in mot blodbanan och börja bilda en helt annan uppsättning proteiner. Istället för proteiner som ingår i den kontraktila apparaten kommer syntes av bindväv, tillväxtfaktorer och ytreceptorer att vara övervägande. Man refererar ofta till denna process som en övergång av muskelceller från en kontraktil till en syntetisk fenotyp. Muskelceller kan isoleras från vävnader och bevaras i odling. Odlade glatta muskelceller genomgår dock oundvikligen och snabbt ändringar i fenotyp, som påminner mycket om de som sker under aterosklerosprocessen i vanliga fall. Odlade muskelceller har därför använts av många forskargrupper för att studera hur fenotypförändringar styrs. En nackdel i detta sammanhang är att man med odlade celler endast kan studera väldigt sena stadier i denna process. För att komma åt tidigare skeenden i använde vi oss istället av vävnadsodling. Vid odling av intakta blodkärl tycks dedifferentieringsprocessen vara mycket fördröjd i jämförelse med odling av celler. Endast små förändringar i kontraktilitet eller ultrastruktur inträffar efter några dagar i odling. Ett av målen för denna avhandling var därför: ' att studera förändringar i intracellulär signalering under tidiga stadier av cellulär dedifferentiering i intakt vävnad. Delarbete I och II visade att stora förändringar i intracellulär kalciumhantering inträffar i artärer efter tre eller fyra dagar av vävnadsodling. Intracellulära kalciumförråd var mycket uppreglerade, vilket var fallet även för specifika kalciumkanaler (’store operated calcium channels’) i cellmembranet. Uppreglering av kalciumförråd kunde även induceras genom att öka den yttre kalciumbelastningen under odlingsperioden (I), men omställningarna tycks till största delen var betingad av odlingen som sådan. Hur detta relaterar till andra dedifferentieringsmarkörer, och till den egentliga sjukdomsprocessen är intressanta frågor. Möjligheten finns att omställningen i kalciumhantering inte bara är en följd av en ändrad fenotyp, utan att den skulle kunna var nödvändig för att driva sådana förändringar. Studier av odlade celler ger ett visst stöd för denna hypotes. Kalcium styr inte bara kontraktion, utan är även viktigt för reglering av celldelning, migration, för många enzymer och för genuttryck. För att denna mångfald skall vara möjlig, och samtidigt någorlunda selektiv är kalciumsignaler väl definierade både i rum och tid. Signaler kan ha mycket varierande utbredning och lokalisation i celler, lika väl som de kan vara väl begränsade i tiden, och uppdelade i korta pulser, vågor eller ihållande ökningar. Kunskapen om kodning av kalciumsignaler är ny, och det är ännu långt ifrån utrett vilka funktioner som är knutna till olika typer av kalciumsignaler. Denna avhandling syftar till att ta reda på: ' vilka cellstrukturer som ger upphov till intracellulära kalciumvågor. Vi visade att kalciumvågor är helt beroende av frisättning av kalcium från intracellulära förråd, via den s.k. inositol 1,4,5-trisfosfat receptorn (III), men också att tömning av kalciumförråd, vilket leder till utslagning av kalciumvågor, också hämmade kontraktion som svar på hormon (IV). Kolesterolrika membranregioner undersöktes (V) genom att artärer utsattes för en kolesterolbindande polymer, som får dessa membran att förlora sin normala struktur. Detta hade liten inverkan på bildandet av kalciumvågor, men en drastisk effekt på kopplingen från vissa ytreceptorer till kontraktion. Detta talar för att vissa receptorer eller signalvägar nedströms om dessa är lokaliserade till kolesterolrika membranregioner, eller interagerar direkt med kolesterol. Möjligheten att höga kolesterolnivåer i blodet skulle kunna påverka blodkärlens funktion är intressant och har studerats av många grupper. Om våra fynd kan relateras till sådana modeller är dock osäkert, och föklaringen till att kolesterol påverkar kopplingen mellan receptorer och olika signalvägar måste undersökas ytterligare. Många blodkärl dilaterar när omkringliggande vävnad behöver mer blodtillförsel. Detta beror förmodligen på syrebrist, eller andra effekter av ökad metabolism. Mekanismerna bakom detta är ännu inte förstådda. Vi undersökte: ' om en ändrad kodning av kalciumssignaler kan förklara varför blodkärl vidgas vid metabol hämning. Kontraktion och kalciumsignallering under stimulering undersöktes med hämmare av cellulär energiproduktion (IV). Märkligt nog leder de flesta sådana hämmare till att kärl nästan helt relaxerar, utan att uppmätta kalciumnivåer är påtagligt sänkta. Vi upptäckte däremot att kodningen av kalciumsignaler var mycket påverkad av hämmarna under stimulering med hormon. Kalciumvågor uppvisade en markant ökning i frekvens, med en minskad amplitud som följd, efter hämning. En sådan omställning i kodningsmönster skulle kunna förklara varför blodkärl relaxerar efter metabol hämning. Metoder som använts var främst kraftmätning ifrån svans- och basilar-artärer från råtta. Kalcium mättes på vävnads och subcellulär nivå med fluorescerande indikatorer med konventionell fluorescens-mikroskopi och konfokal mikroskopi. Biokemiska bestämningar av receptorer och proteinfosforylering, samt vävnads-fraktionering av var också viktiga metoder. I delarbete I, II och III jämfördes akut preparerade kärl med artärer efter tre till fyra dagars vävnadsodling, men även med artärer som behandlats under denna tid med farmaka som påverkar kalciumhantering.