HEMOPHILIA A AND B WITH SPECIAL REFERENCE TO INHIBITOR DEVELOPMENT AND EXPERIMENTAL STUDIES OF FACTORS VIII AND IX

Abstract: Popular Abstract in Swedish Syftet med denna avhandling är att studera den vanligaste behandlingskomplikationen vid blödarsjuka, antikroppsbildning, samt att studera sambandet mellan genen som orsakar sjukdom och det protein som denna gen kodar för. Det övergripande syftet är att forskningsresultaten ska kunna användas för att förbättra vården för familjer med blödarsjuka (hemofili). Resultaten visar att bland blödarsjuka typ B i Sverige har vi en hög frekvens av en typ av mutation (fel i genen) som ger högre risk för att man utvecklar antikroppar mot (ej svarar på) den sedvanliga behandlingen. Dessutom kan vi visa att risken för antikroppar inte har ökat de senaste tio åren när mer moderna genteknologiskt framställda preparat börjat användas. Hur länge man ammar påverkar inte heller faran för att utveckla antikroppar. Vi föreslår dock att vissa specifika förändringar i proteinet ökar risken. Genom datormodeller av proteiner blödarsjuka saknar och biokemiska experiment kan vi visa en mer detaljerad bild av hur blodets levring går till på molekylär nivå. Därigenom kan man ytterligare förklara vad en förändring i genen ger för effekt på proteinet och hur blödarsjuka uppstår. Vi kunde ej visa att typen av förändringen i genen påverkade koagulationsaktiviteten hos bärare av blödarsjuka, däremot kunde vi kartlägga hur känslig denna väl använda laboratoriemetod är. Allmän bakgrund om blödarsjuka Människan har länge haft kunskap om blödarsjuka. Sjukdomen beskrevs redan i den babyloniska Talmud på 400-talet. Mycket av dagens kunskap härstammar dock från 1803 då den amerikanske läkaren John Conrad Otto (1744-1844) beskrev och namngav sjukdomen. Han skriver ”Blödarsjuka är en medfödd ärftlig sjukdom som endast drabbar män men ärvs genom kvinnor, vid vilken man har förlängd koagulationstid och upprepade ledblödningar”. Sjukdomen har också har kallats för den ”europeiska kungasjukan”. Bland andra led kronprins Alexis (1904-1918) i den sista ryska kejsarfamiljen av svår blödarsjuka. Även Englands drottning Victoria (1819-1901) var bärare av sjukdomen och hade flera sjuka manliga släktingar spridda i Europas kungahus. Blödarsjuka drabbar män (1/5000) och är en X-kromosomalt recessivt nedärvd sjukdom (jmf med dr Ottos beskrivning). Sjukdomen förekommer i två varianter hemofili A respektive B som orsakas av brist, avsaknad av eller dåligt fungerande koagulationsfaktor VIII (FVIII), typ A, eller IX (FIX), typ B, i blodet. I ca 50 % av fallen finns ingen person med blödarsjuka i släkten. Dessa nya (spontana) mutationer har uppstått i någon av de föregående generationerna och har sedan ärvts enligt ovanstående mönster. Hälften av patienterna med svår hemofili A har ett fel i genen som kallas inversion (del av genen ”bak och fram”). De patienter med svår hemofili A som inte har inversion, patienter med moderat eller mild hemofili A samt hemofili B patienter, uppvisar ett brett spektrum av mutationer, inklusive stora och små deletioner (avsaknad av DNA-byggstenar, nukleotider), insertioner (extra nukleotider), ”non-sense” (byte av nukleotid, punktmutation, som leder till att avläsningen av genen avstannar) och ”missense” mutationer (punktmutation som leder till utbyte av aminosyra i proteinet). Varje familj har oftast en unik mutation. Beroende på koagulationsaktiviteten av FVIII resp FIX i blodet indelas sjukdomarna i svår (<1 % av normal aktivitet), moderat (1-5%) och mild (6-25%) form. Koagulationsaktiviteten är beroende av vilken mutation man har, varför svårighetsgraden är densamma hos alla blödarsjuka i en familj. Vid de svårare formerna diagnostiseras sjukdomen ofta vid 7-8 månaders ålder pga blödningar i hud, leder, slemhinnor och muskler, eller pga intrakraniella blödningar. Vid de mildare formerna brukar man emellertid inte ha några spontana blödningsbesvär, varför diagnosen ofta ställs betydligt senare i livet, t ex efter att patienten uppvisat ökad blödningstendens i samband med kirurgiskt ingrepp, vid tandextraktion eller vid trauma. Hemofili A och B ger samma kliniska bild. Utan behandling leder de svårare formerna till tidig invaliditet pga skadade leder. Obetydliga trauma kan också orsaka utbredda, inte sällan livshotande, blödningar. I Sverige behandlas sedan flera decennier blödarsjuka profylaktiskt, dvs. förebyggande, genom intravenösa injektioner med faktorkoncentrat 2-3 gånger/vecka. I många andra länder, och vid mild blödarsjuka, behandlar man enbart vid blödningsbesvär (”on demand”). Sedan början av 1990-talet finns faktor VIII och IX koncentrat framställda med DNA-teknik. Tidigare renades de fram från blodgivarplasma. En mycket allvarlig komplikation till hemofilibehandlingen är utvecklandet av antikroppar (inhibitorer) mot FVIII/FIX. Cirka 20 % av de svenska patienterna med svår hemofili A och cirka 35 % av de med svår hemofili B utvecklar antikroppar. Det är ovanligt att patienter med mild hemofili utvecklar antikroppar. Patienter med antikroppar kan inte få sedvanlig profylax och kan därför drabbas av allvarliga blödningar. Flera studier har visat att det finns ett samband mellan typen av mutation och risken för att utveckla antikroppar. I denna avhandling har vi studerat både incidensen (antalet som insjuknat) och möjliga riskfaktorer (epidemiologiska, genetiska, kliniska samt biokemiska) för antikroppsutveckling hos svenska blödarsjuka patienter (arbete I, II, III). Denna typen av studier skulle kunna användas för att förutsäga vilka patienter som löper störst risk att utveckla antikroppar, och därmed kan man skräddarsy behandlingen. Delarbete I, II och III Blodets koagulation, FVIII och FIX Hemostas är en medicinsk term som används för att beskriva kroppens förmåga att permanent stoppa en blödning. Blodets levring sker i första steget mellan kärlvägg och blodplättar. Nästa steg, koagulationen, är ett samspel mellan blodplättar och olika proteiner, såsom proenzymer, aktiva enzymer och kofaktorer (ofta benämnda med romerska siffror och den aktiva formen med ett litet a efter sig), samt negativt laddade ytor som exponeras i samband med kärlskador. FVIII och FIX är viktiga komponenter i detta system (markerade med rött i fig. 1). Vid brist på dessa kan blodet inte levra sig normalt. Figur 1. Blodkärl där nedre kärlväggen är skadad. Förenklad bild av komponenterna i koagulationen och de cellytor som den sker på. Initieringen sker på ”Tissue factor” (TF)-bärande celler, där faktor VII binds och aktiveras. Detta komplex kan sedan aktivera, både FIX och till viss del FX. En liten mängd trombin bildas initialt, som bland annat aktiverar FVIII, som i sin tur släpper sitt bärarprotein och binder till ytan av trombocyter. Ett komplex av enzymet FIXa och dess kofaktor FVIIIa aktiverar (bundna till trombocytytan) FX, som i sin tur, i komplex med sin kofaktor, aktiverar protrombin till trombin. Trombin, nu i större mängder, klyver fibrinogen till fibrin, och ett trådigt nätverk, vårt ”blodkoagel”, bildas. FVIII är ett protein som består av 2332 aminosyror, se även figur 6 och 7. Genen för FVIII, 186 kilobaser (kb), är en av kroppens största med 26 exoner. FIX genen, 33.5 kb, innehåller 8 exoner som kodar för proteinet (serinproteas) FIX med 415 aminosyror (se figur 4 och 5). Vi har studerat sambandet mellan genotyp och struktur/funktion av proteinet FIX, dels biokemiska studier av mutationer i FIX, dels kliniska studier avseende huruvida genotypen påverkar FIX koagulationsaktiviteten hos kvinnliga bärare av hemofili B. Delarbete IV, V och VI Sammanfattning av avhandlingens studier I delarbete I var syftet att kartlägga frekvens av och riskfaktorer för utveckling av antikroppar mot FVIII respektive FIX hos svenska patienter födda 1980-1999 med svår hemofili A (100 st) eller B (16 st). Mutationerna hos alla de patienter som hade antikroppar kartlades. Frekvensen av antikroppar för hemofili A resp. B var 19% resp. 38%. Detta innebär att svenska barn med hemofili B har en extremt hög risk att utveckla antikropppar. Orsaken tycks vara att vi har högre frekvens av gendeletioner (förlust av genen eller del av den) i vår befolkning. Vi kunde inte påvisa någon ökning av antikroppsbildningen under 1990-1999 vilket är den tid då rekombinanta preparat började användas i större omfattning. I delarbete II undersökte vi om amningens längd hade någon betydelse för utveckling av antikroppar med tanke på de eventuella skyddande egenskaper bröstmjölken kan ha på tarmen, och därigenom på immunförsvaret. Vi fann att amning inte påverkade risken för antikroppsutveckling. I delarbete III har vi påvisat s.k. ”missense” mutationer i två familjer med mild hemofili A, där flera patienter har utvecklat antikroppar. Vi studerade vidare proteinstrukturen av FVIII hos dessa familjer via datormodeller för att få en uppfattning om den bakomliggande mekanismen för dessa patienters utvecklande av antikroppar. Samtidigt studerade vi funktion och produktion av proteinet för att få en ökad förståelse för uppkomsten av blödarsjuka. Resultatet var att dessa två mutationer orsakar blödarsjuka pga att de ger lokala förändringar i proteinets struktur, vilket kan orsaka minskad utsöndring ur levercellen, eller möjligen minskad bindning till bärarproteinet (von Willebrand faktor, vWF). Dessa förändringar sitter i regioner och ytstrukturer i FVIII som är förenliga med ökad immunogenicitet. I delarbete IV studerades, genom rekombinant (DNA-teknik) framställda, proteiner med de mutationer som vi funnit hos två familjer med mild blödarsjuka. Patienterna har mutationer i EGF domänen av FIX (Pro55Ser, Pro55Leu) och halten protein (FIXAg) är högre än nivån av funktionen (FIXC), vilket tyder på en sämre funktion och inte bara en minskad produktion av protein. Vi fann att protein med mutationen Pro55Leu klyvs i andra ändan av proteinet vid aktivering av både FXIa och FVIIa/TF, vilket orsakar minskad koagulationsaktivitet. Detta tyder på en intramolekylär kommunikation mellan olika delar i FIX. FIX Pro55Ser omvandlas normalt till sin aktiva form men har dålig förmåga att aktivera nästa steg, dvs. FX till FXa. Resultaten av dessa försök visar att EGF1 i FIX ej deltar i aktivering via FVIIa/TF, och inte heller interagerar direkt med FVIII. Dessa resultat ger en mer detaljerad bild av hur koagulationen fungerar och kan ligga till grund för t ex datormodeller (figur 14). I delarbete V studerades 100 kvinnliga släktingar till blödarsjuka pojkar med hemofili B. Familjernas mutationer kartlades om de inte redan fanns registrerade. För kvinnorna fanns flera uppmätta värden på FIX koagulationsaktivitet (FIXC). När man är bärare av blödarsjuka (och har en mutation i genen för FIX) har man oftast inga blödningsbesvär, då kvinnor (XX) i motsats till män (XY) har två X-kromosomer (en frisk respektive en sjuk). Vi fann ingen skillnad på nivån av FIXC som kunde relateras till typ av blödarsjuka (mild, moderat eller svår) eller till den genetiska förändringen (typen av mutation) i familjen. Med tanke på att FIXC är det vanligaste sättet att förutsäga bärarskap, fick vi genom denna studie en god bild av dess sensitivitet och specificitet. I delarbete VI undersöktes en s.k. tyst mutation, G17736A, Val107Val som har påvisats i fem familjer med mild hemofili B. Familjerna har alla FIXC och FIXAg i nivåer mellan 15 och 20 % jämfört med normalt. Skiftet av nukleotid borde, enligt den ”genetiska koden”, inte innebära någon förändring av aminosyrasekvensen. Arbetet syftade till att studera hur hemofili uppstår i dessa familjer. Vi fann ingen annan mutation i genomiskt DNA. FIX mRNA studerades också för att finna eventuella transkriptionsfel som mutationen skulle kunna ha orsakat (när DNA översätts till RNA). Vi fann inga fel i mRNA, dvs. inga tecken på överhoppade exon eller kvarlämnade intron.