Physiology and Pharmacology of GABAA receptors: The Brakes in the Brain

Abstract: Popular Abstract in Swedish Den huvudsakliga hämmande signalsubstansen i hjärnan är GABA (gamma-aminobutyric acid, gamma-aminosmörsyra). GABA finns i ungefär hälften av alla nervceller i hjärnan och alla nervceller i hjärnan antas ha receptorer som binder GABA. Om man tänker på alla de normala neurologiska funktioner samt rubbningar där GABA är involverat är det inte svårt att förstå GABA:s oerhörda betydelse för ett fungerande nervsystem. Dessa olika tillstånd innefattar exempelvis inlärning, minne, sömnreglering, smärta, ångest, epilepsi, muskeltension och beroende, som t.ex. alkoholberoende. Den vanligaste receptorn för GABA kallas GABAA receptorn. Receptorn är en jonkanal som normalt är stängd men som kan öppnas av GABA och väl öppen släpper jonkanalen igenom negativt laddade kloridjoner. Varje GABAA receptor byggs upp av fem subenheter. Dessa subenheter kan kombineras från en pool av 19 olika subenheter och beroende på hur de sätts samman bildas receptorer med olika egenskaper t.ex. känslighet för GABA och läkemedel som benzodiazepiner (t.ex. valium®). Olika regioner i hjärnan har GABAA receptorer vars sammansättning av subenheter och därmed egenskaper varierar och receptorer med olika subenheter kan även finnas på olika delar av samma nervcell. I mitt avhandlingsarbete har jag använt en metod som kallas patch-clamp för att studera GABAA receptorers fysiologiska och farmakologiska egen-skaper. I arbete I och II har singelkanalregistrering använts på nervceller i hjärnsnitt från råtta medan arbete III och IV utfördes med helcellsregistrering på Sf 9 celler (insekts-celler) vilka manipulerats att presentera GABAA receptorer på cellytan. Nedan följer en kort beskrivning av de resultat och slutsatser som kan dras från delarbetena som utgör detta avhandlingsarbete. GABA är involverat i två typer av hämning, inhibering, i hjärnan. Den traditionella första typen av inhibering kallas ?phasic inhibition? och innebär snabb, riktad signalering mellan två nervceller i det kontaktområde som kallas en synaps. Vid denna typ av signalering frisätts en hög koncentration av GABA som på ett synkroniserat sätt aktiverar GABAA receptorer på mottagarcellen inom en tusendels sekund. Den andra typen av inhibering, ?tonic inhibition?, involverar GABAA receptorer som inte hittas i synapsen utan utanför denna, extrasynaptiskt. De extrasynaptiska GABAA receptorerna (GABARex) är ständigt omgivna av de låga GABA koncentrationer som existerar runt nervcellerna i hjärnan. Jämfört med phasic inhibition är tonic inhibition ett relativt nyupptäckt fenomen och betydligt mindre är känt om de GABAA receptorer som ligger till grund för denna form av inhibering. I det första delarbetet har vi på singelkanalnivå studerat extrasynaptiska GABAA receptorer i en hjärnstruktur som kallas hippocampus. Denna hjärnstruktur anses vara viktig för minne och inlärning och är på grund av sin enkla organisation av celler i väldefinierade lager ofta studerad i patch-clampförsök. Vi fann att GABA aktiverade tre typer av GABARex kanaler. Jonkanalerna hade olika känslighet för GABA, olika maximala strömmar och påverkades olika av substanser med specifika krav på subenhetsuppsättning för effekt på GABAA receptorer. De olika egen-skaperna indikerar att de tre typerna av receptorer är uppbyggda av olika subenheter. Gemensamt för receptorerna var att de alla aktiverades med en fördröjning vilket skulle kunna reflektera ett säkerhetssystem där receptorerna endast aktiveras om GABA är där för tillräckligt lång tid och förhindrar därmed receptoraktivering vid en eventuell tillfällig ökning i GABA nivån. De låga koncentrationer av GABA som receptorerna lyckades känna av motsvarar de nivåer som normalt existerar runt nervcellerna i hjärnan. Förekomsten av GABAA receptorer med olika känsligheter för GABA kan ligga till grund för ett hämmande system som kan styras av GABA på ett graderat sätt. I delarbete II har vi studerat effekterna av en substans kallad THIP på enskilda extrasynaptiska GABAA kanaler i hippocampus. THIP är en substans som tagits fram av läkemedelsföretaget Lundbbeck i samarbete med Merck, Sharp & Dome och som i dagsläget är i klinisk prövning som sömnmedel. Vi fann att THIP aktiverade GABAA kanaler på ett sätt som påminner om när låga koncentrationer av GABA aktiverar kanalerna. Med en fördröjning aktiverades först små kanaler (mindre ström) som sedan följdes av aktivering av större kanaler (större ström). De THIP-aktiverade kanalerna hade liknande elektriska egenskaper som GABA-aktiverade kanaler och kunde påverkas av diazepam (valium®). Den tid det tog för THIP att aktivera de större kanalerna var dels beroende av koncentrationen av THIP dels av närvaron av diazepam. I tidigare publikationer har det visats att GABAA receptorer som innehåller den relativt sällsynta subenheten epsilon eller som bär på mutationer kan öppnas spontant d.v.s. utan att GABA binder till receptorn. I det tredje arbetet undersökte vi huruvida även GABAA receptorer bestående av vanligt förekommande subenheter, alpha1, beta1 och gamma2s kan öppnas spontant. För att undersöka detta använde vi substansen penicillin, vilken har förmågan att blockera GABAA receptorer genom att sätta sig som en plugg i den öppna jonkanalen och hindra joner från att passera igenom. Vår hypotes var som följer; om receptorerna öppnar sig spontant kan penicillin plugga igen dem en efter en allteftersom de öppnas och på så sätt samla kanalerna i ett öppet men igenpluggat tillstånd. När sen penicillin tvättas bort från cellen så skulle kanalerna vara tillfälligt öppna innan de hinner återgå till sitt stängda tillstånd och under tiden de är öppna kan kloridjoner flöda igenom kanalerna och vi kan registrera detta som en ström. Genom att testa denna hypotes fann vi att både alpha1beta1 och alpha1beta1gamma2s receptorer kunde öppna sig spontant. Den fysiologiska relevansen av spontana GABAA receptorer är i dagsläget inte fastställd men dessa receptorer skulle kunna bidra till de snabba GABA-svar som ses t.ex. vid synapser. I det fjärde, och sista, delarbetet har vi studerat hur den kompetitiva hämmaren SR95531 och GABA interagerar med alpha1beta1 och alpha1beta1gamma2s GABAA receptorn. Med kompetitiv menas att SR95531 och GABA tävlar om samma bindningsställen på receptorn. Hur väl SR95531 lyckades hämma de GABA aktiverade strömmarna berodde på när SR95531 och GABA tillsattes relativt till varandra. SR95531 visade sig vara betydligt mer effektiv att hämma receptorerna då det tillsattes innan GABA jämfört med om det tillsattes tillsammans med GABA. Vidare fann vi att alpha1beta1gamma2s receptorer var mer känsliga för hämning av SR95531 jämfört med alpha1beta1 receptorer och att SR95531 påverkade olika faser av den GABA aktiverade strömmen med olika effektivitet. Vi utformade en modell för att förklara våra data. Denna modell inkluderade två bindningsställen för GABA och SR95531, där bindning av GABA men inte SR95531 till receptorn leder till öppning av jonkanalen. Med hjälp av vår framtagna modell simulerade vi effekten av SR95531 på receptorer uttryckta i synapser samt extrasynaptiskt. Resultaten i den här studien är relevanta för förståelse av GABA:s och dess hämmares interaktion med GABA-receptorer.