Genomic profiling of breast cancer by microarray-based technology and bioinformatics

Abstract: Popular Abstract in Swedish Bröstcancer är den vanligaste cancerformen bland kvinnor i Sverige. Mer än 7000 kvinnor insjuknar varje år i bröstcancer, och cirka 1500 dör i sjukdomen. Incidensen av bröstcancer har stigit kontinuerligt sedan 1970-talet, och man uppskattar att en av tio kvinnor i Sverige kommer att utveckla bröstcancer någon gång under sin livstid. Den relativa överlevnaden i sjukdomen har dock parallellt förbättrats, och idag är 10-års överlevnaden ca 80%. Intensivt forskningsarbete har uppdagat att bröstcancer är en synnerligen heterogen och komplex sjukdom, med stora skillnader i biologi, ärftlighet, prognos, och behandlingssvar. Bristen på pålitliga faktorer för att förutbestämma risk och behandlingssvar medför att en betydande andel bröstcancerpatienter idag sannolikt överbehandlas, medan andra får för lite eller fel behandling. Stora forskningsinsatser har gjorts för att bättre karakterisera bröstcancer genom studier av förändringar i arvsmassan (DNA) och förändringar i uttrycket av gener (RNA) i tumörvävnad. Ett av målen med dessa studier har varit att definiera nya undergrupper av bröstcancer med prognostisk och behandlingsprediktiv betydelse, vilket i förlängningen kan leda till mer individualiserad behandling. Denna avhandling består av fem delarbeten där det övergripande målet har varit att utveckla och använda microarray baserade verktyg för att undersöka mönstret av genomiska (DNA) och transkriptionella (RNA) förändringar i bröstcancer. Brösttumörer uppvisar ofta stora avvikelser i arvsmassan, i form av exempelvis förlust eller ökning av antalet kopior av enskilda gener eller hela kromosomer. Frekvent förekommande DNA avvikelser kan indikera gener som är av betydelse för tumörutveckling och som kan utgöra mål för nya riktade läkemedel. I de två första delarbetena utvecklades microarray baserade teknikplattformar för jämförelse av antalet genkopior i cancerceller och normala celler (array-Comparative Genomic Hybridization, aCGH). Med aCGH kan genomiska förändringar kartläggas i hög detalj över tiotusentals mätpunkter spridda över hela det mänskliga genomet. I delarbete ett utvecklades en aCGH plattform baserad på längre genomiska fragment i Bacterial Artificial Chromosome (BAC) kloner, för kartläggning av förändringar över hela genomet i brösttumörer. I delarbete två utvecklades en aCGH plattform baserad på mycket korta DNA fragment (60 baser). Målet med denna plattform var att kunna detektera mycket små genomiska avvikelser inom enskilda gener. Sådana avvikelser kan exempelvis hittas nedärvda i arvsmassan hos kvinnor med ökad risk för bröstcancer. I delarbete ett fann vi även att befintliga metoder för vissa delsteg i analysen av aCGH data fungerade sämre för tumörprov med många genomiska avvikelser. I delarbete tre utvecklades därför en förbättrad metod för normalisering av aCGH data. Den förvärvade kunskapen från de första tre delarbetena användes i delarbete fyra för att karakterisera genomiska förändringar i brösttumörer med amplifiering (många extra genkopior) av HER2 genen på kromosom 17. HER2 tillhör en familj av tillväxtfaktorreceptorer som återfinns i cellmembranet, och som har en intracellulär tyrosinkinasaktivitet. Cirka 10-25% av all primär bröstcancer uppvisar ett ökat antal kopior (amplifiering) av HER2 genen, och i slutet av 1980-talet beskrevs kopplingen mellan amplifiering av HER2 (HER2+) och dålig prognos. Fortsatt forskning har visat att orsaken till att patienter med HER2+ tumörer ofta har dålig prognos beror på att ökade protein nivåer av HER2 receptorn ger tumörcellen viktiga fördelar (ökad tillväxthastighet och rörlighet, minskad celldöd), vilket resulterar i mer aggressiva tumörer. Relativt kort därefter isolerades en antikropp som selektivt kunde binda till HER2 receptorn på cellytan och hämma dess tumörfrämjande egenskaper. Baserat på resultaten av flera stora kliniska studier har riktad antikroppsbehandling mot HER2 nu blivit klinisk rutin för bröstcancer patienter med HER2+ sjukdom. Trots det enorma fokus som riktats mot HER2+ bröstcancer, finns en bristande kunskap om andra genomiska förändringar i dessa tumörer. I delarbete fyra använde vi därför aCGH för att kartlägga genomiska förändringar i 200 HER2+ tumörer. Med hjälp av aCGH kunde vi med hög noggrannhet definiera den minsta amplifierade regionen som innefattade förutom HER2 även fem andra gener. Vidare fann vi att HER2+ tumörer uppvisade komplexa och heterogena genomiska profiler med bl.a. återkommande amplifieringar av andra genomiska regioner, olikt andra undergrupper av bröstcancer. Vi identifierade ett flertal sådana frekvent förändrade genomiska regioner i HER2+ brösttumörer, varav vissa var mer frekventa i olika undergrupper av HER2+ tumörer. Fynden i delarbete fyra understryker den heterogenitet av genomiska förändringar som finns i HER2+ tumörer jämfört med andra undergrupper av bröstcancer. Även om patienter med HER2+ sjukdom historiskt har betraktats ha en sämre prognos så utvecklar inte alla patienter metastaserande sjukdom. En betydande andel av HER2+ patienter uppvisar dessutom resistens, antingen från start eller under behandling, mot riktad antikroppsbehandling. Det finns därför ett stort värde i att förbättra stratifieringen av HER2+ patienter i olika riskgrupper. I delarbete fem användes en kombination av aCGH och microarray baserad analys av genyttrycket (RNA) i HER2+ tumörer för att söka efter nya undergrupper med möjlig klinisk betydelse. Via analys av genuttrycksmönstret i 58 tumörer identifierade vi tre undergrupper av HER2+ tumörer. Dessa tre grupper uppvisade olikheter i association till olika kliniska variabler, och dessutom skillnader i prognos. Speciellt en undergrupp hade en klart sämre prognos jämfört med de andra två. Skillnaden i prognos föranledde oss att (1) identifiera vilka gener som karakteriserade undergruppen med sämre prognos, och (2) skapa en genexpressions baserad prognostisk prediktor utifrån dessa gener. När vi validerade prediktorn i flera oberoende bröstcancer material fann vi att den kunde identifiera inte bara HER2+ patienter med sämre prognos, utan även bröstcancer patienter med sämre prognos i andra högriskgrupper oavsett HER2 status. Sammanfattningsvis har delarbetena i denna avhandling visat på styrkan hos microarray baserade plattformar i att kartlägga stora som små avvikelser i arvsmassan, samt transkriptionell deregulering i brösttumörer. Sammantaget har detta bidragit till ökad kunskap om brösttumörer med amplifiering av HER2 genen, vilket kan komma att vara betydelsefullt för bättre prognostisering och selektion av HER2+ patienter för nya behandlingsalternativ.