Retroviral gene transfer to repopulating hematopoietic cells

Abstract: Popular Abstract in Swedish Blodbildande stamceller förekommer i mänsklig benmärg i en frekvens på ca 1/100 000 celler. Med hjälp av cellytemarkörer, t.ex. CD34, kan man rena fram cellpopulationer som är anrikade på stamceller, men det saknas exakt kunskap om hur enskilda stamceller ser ut. De blodbildande stamcellerna har förmåga att vid celldelning antingen förnya sig själva eller att mogna ut. Stamcellerna kan mogna ut och föröka sig till alla typer av blodceller: röda blodkroppar, olika typer av vita blodkroppar och blodplättar (trombocyter). Genterapi är en experimentell behandlingsform som bygger på att nytt genetiskt material förs in i celler. Man har kommit längst inom genterapi riktad mot ärftliga sjukdomar som drabbar blodbildande stamceller. Teknikerna har prövats i djurförsök och de senaste 10 åren också i försök att behandla sjukdomar hos människor. År 2000 rapporterades det första stora genombrottet inom genterapi vid behandlig av en ovanlig immunbristsjukdom (SCID). Man utnyttjar s.k. retrovirus, som har förmåga att införa sitt genmaterial i celler som infekteras. Dessa virus har modifierats till sk. vektorer, som innehåller en önskad gen, och kan infektera t.ex. stamceller och då föra över genmaterial en gång, men sedan inte föra infektionen vidare. Fördelen med retrovirala vektorer är att de permanent kan föra in nytt genetiskt material i celler som infekteras (transduceras), men detta är också en nackdel eftersom det medför en risk för oönskade genförändringar i mottagarcellerna. En annan nackdel är att dessa virus kräver att mottagarcellen genomgår celldelning för att kunna transduceras. Eftersom blodstamceller i vanliga fall sällan delar sig, måste de odlas och stimuleras med olika tillväxtfaktorer för att bli mottagliga för retrovirus. Odlingsproceduren medför risk att cellerna mognar ut och förlorar sina unika stamcellsegenskaper, eller att deras förmåga att slå an i benmärg efter transplantation försämras. Målet med denna avhandling har varit att vidareutveckla metoder för retrovirusbaserad genöverföring till mänskliga blodstamceller i syfte att i framtiden kunna erbjuda genterapibehandling till patienter med olika blodsjukdomar. Vi har använt vektorer som innehåller en markörgen, GFP, green fluorescent protein, som blir självlysande i ultraviolett ljus och kan påvisas med hjälp av mikroskop, flödescytometri eller molekylära metoder. I arbete I, som utfördes med musceller, utvärderades en genöverföringsmetod som bygger på långtidsodling av blodbildande celler på en matta av bindvävsceller från benmärg med tillförsel av vektor vid två tillfällen. Efter 3 veckor skördades cellerna och transplanterades till mottagarmöss. Våra resultat visade att genöverföringen var föga effektiv och att de genmodifierade cellerna förlorade mycket av sin förmåga att slå an och växa ut i mottagardjurens benmärg. I arbetena II-IV undersöktes genöverföring till mänskliga blodbildande celler, vilka efter genöverföring tranplanterades till immundefekta möss (NOD/SCID-stam), vilka har förmåga att understödja mänsklig blodbildning och som anses vara den bästa tillgängliga metoden att analysera blodstamceller. I arbete II studerades vektorer som försetts med virushöljen från tre olika virus avseende förmågan att föra över gener till blodbildande celler. Vi fann då att genöverföringen med ett virushölje (från Gibbon Ape Leukemia virus) hämmades under vissa förhållanden. Sannolikt kunde hämningen orsakas av förekomst av icke-fungerande viruspartiklar samt låga nivåer av receptorer för retrovirus på cellytan, och vi utarbetade en effektiv metod för genöverföring. I arbete III studerades denna hämning vidare och vi undersökte effekterna av att på olika sätt öka förekomsten av receptorer för GALV-virus på de mänskliga blodcellernas yta. En slutsats som kunde dras var att låga nivåer av GALV-receptorer på de humana blodstamcellerna var en väsentlig faktor som bidrog till att förhindra effektiv genöverföring med retrovirala vektorer. I arbete IV jämfördes slutligen tre retrovirala vektorer som försetts med olika höljeproteiner avseende förmågan att föra över en markörgen till humana blodstamceller transplanterade till NOD/SCID-möss. Trots betydande skillnader i genöverföring vid analys av celler omedelbart efter odling var genöverföringsfrekvensen till primitiva (stam-) celler i NOD/SCID benmärg lika för alla tre vektortyperna. Dock kunde endast GALV-vektorn användas under odlingsbetingelser utan serum, vilket är eftersträvansvärt. Genöverföring till ca 50 % av mänskliga blodbildande stamceller kunde uppnås med GALV-vektor utan serum, då man också fann välbevarad förmåga hos de genmodifierade cellerna att transplanteras och ge upphov till ny blodbildning. Sammanfattningsvis har vi utvecklat metoder för effektiv retroviral genöverföring till blodbildande stamceller hos människa. Dock hämmas behandlingsmetodens praktiska tillämpning av två nyligen rapporterade fall av behandlingsutlöst leukemi hos patienter behandlade med genterapi pga. en ärftlig immunbristsjukdom.