Laminin G Domains, their Receptors, and Activation of Intracellular Pathways

Abstract: Popular Abstract in Swedish Extracellulär matrix är namnet på det molekylära nätverk vilket finns mellan celler i flercelliga organismer. Det består av socker och proteiner organiserade i olika vävnadsspecifika nätverk. Två huvudformer finns, basalmembran och interstitiell extracellulär matrix. Basalmembran ligger som en tunn filt under epitel- och endotelceller, runt fettväv, muskler och perifera nerver. Basalmembranens funktion är både fysisk och biologisk, vilket innefattar att stödja och separera celler från den interstitiella extracellulära matrixen samt att reglera cellers funktioner genom interaktioner med cellytereceptorer. På molekylär nivå är de huvudsakliga beståndsdelarna i basalmembran lamininer, typ IV collagener, nidogener och proteoglycaner som perlecan och agrin. Lamininer är en växande familj av glykoproteiner. De är multidomän proteiner vilka består av tre genetiskt olika kedjor, benämnda a, b, och g. Hittills har man funnit 5 a-, 3 b- och 3 g-kedjor. Genom olika kombinationer av dessa 11 kedjor har 15 olika lamininisoformer föreslagits existera. I a-kedjan finns en C-terminal globulär domän, vilken är unik för denna kedja. Den består av fem homologa LG (laminin globulära) moduler i rad. Laminin LG moduler är viktiga för interaktioner med cellytereceptorer och extracellulära ligander. Integriner är viktiga receptorer för cell-cell adhesion och cellers bindning till extracellulär matrix. De är transmembranproteiner bestående av icke-kovalent länkade heterodimerer med en a och en b subenhet. Hos däggdjur kan 8 b subenheter tillsammans med 18 a subenheter bilda 24 olika integriner. Alla integriner med en av eller en b1 subenhet binder till extracellulära matrix proteiner. Inuti cellen binder integrinernas intracellulära delar till signaleringsmolekyler och andra proteiner. Dystroglycan är en receptor, bestående av en a- och en b-kedja vilka båda uttrycks från samma gen. Jämförelser mellan proteinsekvenser indikerar att dystroglycan inte är medlem av någon proteinfamilj utan är en ensam unik molekyl. Dystroglycan är associerad med flera andra proteiner och bildar på så vis ett stort receptorkomplex. Detta receptorsystem finns i muskel, epitel och en del andra vävnadstyper där det länkar cytoskelettet till den extracellulära matrixen. Integriner, dystroglycan och andra transmembran-glycoproteiner som syndecaner har identifierats som cellytereceptorer för lamininer. Regleringen av interaktioner mellan dessa receptorer och lamininer är viktig för många biologiska processer, bland annat cell adhesion, proliferation, differentiering, migration, cellers överlevnad och blodkärlsbildning. Vi har tillverkat rekombinanta laminin a5-kedjeproteiner. Med hjälp av dessa lokaliserade vi bindningsställen för två integriner (a3b1 och a6b1) till laminin a5-kedjans globulära moduler a5LG1-3. Bindningsstället för dystroglycan lokaliserades till laminin a5-kedjans globulära moduler a5LG4-5. Vi fann också att den rekombinant producerade a4-kedjans globulära moduler a4LG4-5 stimulerade endotelcellsadhesion genom interaktioner med integrinerna a3b1 och a6b1, men inte genom interaktioner med avb3. Vi fann att laminin-10/11, vilken består av lamininkedjorna a5b1g1 och a5b2g1, stimulerade adhesion hos epitelcellslinjerna WI-26VA4 och WCCS-1 genom interaktioner med både integrin a3b1 och a6b1. En intracellulär splicevariant (a6A) av integrinreceptorn a6b1 inducerade laminin-1- och laminin-10/11-medierad aktivering av det intracellulära proteinkinaset ERK i WI-26VA4 cells. I WCCS-1 celler, vilka saknade denna splicevariant, aktiverades inte ERK. Korrelation mellan förekomst av denna splicevariant och ERK-aktivering kunde också påvisas i en annan cellinje transfekterad med integrin a6A eller a6B. Hos celler aktiverade av både laminin-1 och laminin-10/11 hämmades integrin a6Ab1-medierad ERK-aktivering av dystroglycanbindande laminindomäner och antikroppar mot dystroglycan. Dessa resultat indikerar att integrin a6Ab1 och dystroglycan har motsatta roller i laminin-medierad ERK-aktivering. Lamininisoformer befanns också spela olika roller vid reglering av cell adhesion, hur cellen breder ut sig efter adhesion, cellers proliferation och ERK aktivering genom interaktioner med integrin a6Ab4. Betydelsen av laminin a4-kedjan för blodkärlsbildning studerades med både in vitro och in vivo modellsystem för blodkärlsbildning. Det rekombinant producerade proteinfragmentet laminin a4LG4-5 förhindrade endotelceller från att migrera och från att bilda tubformade strukturer. Det hade också en hämmande effekt på nybildning av blodkärl från redan existerande kärl i två olika typer av försök. Genom att använda monoklonala antikroppar vilka vi producerat fann vi att både intakta och proteolytiskt processade former av laminin a4-kedjan existerar in vivo.