Sorting and processing of neutrophil granule proteins

Abstract: Popular Abstract in Swedish Sortering av bakteriedödande proteiner till behållarna i vita blodkroppar Vita blodkroppar har en livsviktig roll i det medfödda immunförsvaret som fagocyter, bakterieätare. Denna funktion, första linjens försvar, utövas av neutrofila granulocyter (neutrofiler), en speciell slags vita blodkroppar som är specialiserade på bakterieätning (fagocytos). När bakterier angriper en vävnad vandrar stora mängder av neutrofiler ut ur blodet och bekämpar invasionen. Efter framgångsrikt värv elimineras överflödet av neutrofiler för att förhindra en efterföljande inflammation, som skulle kunna ge allvarlig vävnadsskada och inflammatorisk sjukdom. Genom en kontrollerad form av celldöd (apoptos) går neutrofilerna under på plats och avlägsnas med hjälp av andra celler. Mitt arbete handlar om neutrofilernas upplagringsstationer, det vill säga behållare inne i neutrofilerna som lagrar bakteriedödande proteiner, vilka hålls i beredskap för att släppas ut vid en bakterieinvasion. Under mikroskopet ser dessa behållare ut som korn, de kallas därför för granula. Hur dessa bildas och hur det kommer sig att deras innehåll med en blandning av toxiska och äggvitespjälkande proteiner kan vara stabilt, utan att förstöras under lagringen, något som skulle ske om proteinerna attackerade varandra, är frågan. Behållarna omsluts visserligen av ett membran som normalt hindrar ett läckage som kunde skada cellen. När tiden är mogen spricker emellertid membranet och behållarna tömmer sitt innehåll utanför cellen eller i s k fagocytvakuoler, där bakterierna hamnat efter fagocytos för att förstöras. Det frisatta granulainnehållet har således en viktig roll i infektionsförsvaret. Uppgiften för mitt avhandlingsarbete är att undersöka hur proteiner i neutrofiler bildas, upplagras och förvaras i behållarna fram tills de frisätts vid en bakterieinvasion. Cellens proteinfabrik finns i det endoplasmatiska retiklet (som är en speciell celldel). Efter kvalitetskontroll där exporteras de bildade proteinerna till cellens golgiapparat, en destillations- och sorteringsstation där behållare med koncentrerat innehåll av proteiner bildas genom avknoppning. Proteinerna genomgår en mognadsprocess före och efter upplagringen i behållarna. Proteinerna kvarhålls i golgiapparaten för att i koncentrerad form sorteras för upplagring i behållarna. Om de inte kvarhålls försvinner de ut ur cellen med hjälp av transportblåsor som står för en kontinuerlig proteinutsöndring. Vad som styr att vissa men inte andra proteiner lagras i behållarna är inte känt. Som modellsystem för min forskning har jag av praktiska skäl använt cellinjer, som består av omogna vita blodkroppar som växer kontinuerligt i näringslösning. Både cell- och molekylärbiologiska metoder har utnyttjats för att kunna följa toxiska proteiner på deras väg från framställning i proteinfabriken till upplagring i granula via sorteringsstationen i golgiapparaten. Myeloperoxidas (MPO), som är ett av de bakteriedödande proteinerna, bildas som en omogen kedja med olika subenheter på rad. Först kommer en sk propeptid, därefter kommer en liten och sedan en stor subenhet. I det endoplasmatiska retiklets proteinfabrik börjar den nödvändiga veckningen av proteinkedjan. Kolhydrater och en järninnehållande grupp tillförs. Proteinet kallas i detta skede proMPO eftersom det ännu inte är moget. ProMPO dröjer sig kvar flera timmar i det endoplasmatiska retiklet innan det exporteras till golgiapparaten. Där sker en fortsatt bearbetning av kolhydraterna (artikel II) varefter proMPO lämnar golgiapparaten för upplagring i behållare. Moget MPO är uppbyggt såväl av den lilla som av den stora subenheten. Den sk propeptiden klyvs av och ingår således ej i det mogna proteinet. Propeptiden befanns vara mycket viktig för sortering och upplagring i behållarna. När vi tog bort den så avstannade proteinbearbetningen; moget MPO kunde inte bildas. Dessutom upplagrades inte propeptid-defekt MPO i granula utan bröts ned eller släpptes ut ur cellen via den kontinuerliga proteinutsöndringen (artikel II). Propeptiden visade sig således vara nödvändig för såväl mognad som sortering och upplagring av MPO. Den slutliga mognaden sker troligen först efter det att proMPO hamnat i behållarna. För att bestämma vilka delar av granulaproteinerna (dvs de proteiner som normalt upplagras i behållarna) som är av betydelse för sortering och lagring konstruerades sk chimära proteiner, bestående av delar från olika protein. Vi tog MPOs propeptid och kopplade ihop den med vissa proteiner som normalt utsöndras direkt efter sin tillverkning. De sammanfogade proteinerna stannade kvar i endoplasmatiska retiklet längre tid än det normala proteinet (artikel III). Detta innebär att MPOs propeptid har en kvarhållande funktion i endoplasmatiska retiklet, kanske i syfte att ge tid för proMPO att hinna veckas och ta upp sin järngrupp. De sammanfogade proteinerna fastnade emellertid ofta på vägen i cellens kvalitetskontrollsystem. Vi kunde därför inte avgöra om propeptiden är en signal för sortering till behållarna. Något överraskande var att de omogna vita blodkropparna visade sig kunna kvarhålla och i behållarna upplagra även av oss införda främmande proteiner som normalt inte tillverkas av blodkropparna utan tex av leverceller (artikel I, III). Normalt släpps dessa främmande proteiner ut i blodbanan direkt efter sin tillverkning. Denna upptäckt tyder på att vita blodkroppar, såsom neutrofiler, har en specifik retentionsmekanism (dvs mekanism för kvarhållande) för upplagring i behållarna, något som även skulle kunna utnyttjas för att förändra neutrofilernas innehåll. Denna mekanism gällde dock inte generellt. Somliga proteiner, särskilt om de var stympade eller sammansmälta av två skilda proteiner, accepterades inte för lagring i behållare utan utsöndrades eller bröts ned (artikel II, III). Detta tyder på att upplagringen inte är passiv till sin natur. Kontrollfunktioner förhindrar upplagring av onaturliga proteiner. Specifika sekvenser (sorteringssignaler) för styrning av upplagring kunde inte identifieras. Däremot fann vi att vissa större domäner hos proteinerna var nödvändiga för adekvat upplagring och stabilitet. Ett undersökt proteinet, BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) är uppbyggt av två funktionella halvor. Vi fann att den ena halvan påverkade proteinets hållbarhet i cellerna, medan den andra medverkade vid upplagringen i behållarna (artikel I). Neutrofilerna har flera sorters behållare med olika innehåll. De ingående proteinernas bildas nämligen vid olika tidpunkter och hamnar därför i olika behållare. Om ett protein således skulle bildas vid fel tillfälle och därmed hamna i fel behållare var frågan om det då kunde samsas med de normalt lagrade proteinerna. Med molekylärbiologisk teknik åstadkom vi en tidsförskjuten produktion av ett visst bakteriedödande protein som därmed hamnade i fel behållare och i en för detta protein främmande miljö. Detta ledde till instabilitet hos det felsorterade proteinet (artikel IV). Det normala innehållet i neutrofilernas olika behållare har genom evolutionens försorg anpassats för samexistens så att stabilitet upprätthålls under den relativt långa lagringstiden. Felsorterade proteiner kan således vara instabila i denna miljö. Sammanfattande kan sägas att resultaten tyder på att sorteringen för upplagring i behållarna hos neutrofiler inte är en passiv process. Cellspecifika mekanismer tycks dessutom medföra kvardröjning och upplagring i cellerna där ett proteins fysikalisk-kemiska egenskaper är av betydelse för upplagringen. Mina forskningsresultat har, även om de erhållits genom experiment på cellinjer, kastat nytt ljus över frågor som rör de bakteriedödande proteinernas sortering och lagring i de vita blodkropparnas olika behållare. Kunskapen kan få betydelse för att utveckla nya terapiprinciper vid inflammatoriska sjukdomar.