Gene description, activity quantification and physiological responses of mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenases

Abstract: Popular Abstract in Swedish Liksom du och jag, måste växter andas för att kunna leva. Med hjälp av luftens syre förbränns näring i form av bl a kolhydrater och fetter till koldioxid. Den energi som avges vid förbränningen omvandlas till ATP, som är cellens bränsle. Den huvudsakliga produktionen av ATP sker i den del av cellen som kallas mitokondrien, cellens kraftverk. Vän av ordning kliar sig nu antagligen fundersamt i huvudet och undrar om växter verkligen måste respirera. Han har nämligen hört talas om fotosyntesen, som är den process där koldioxid och vatten med hjälp av solens energi omvandlas till alla de ämnen som växten behöver. Det man bör tänka på är att en stor del av växten består av rötter som befinner sig i mörker under jord. Dessutom går solen som bekant ned på kvällen vilket omöjliggör fotosyntes. Under dessa och många andra tillfällen är det nödvändigt för växten att respirera. Mitokondrien är rund till cigarrformad och är ungefär en mikrometer stor, vilket kan jämföras med storleken på en bakterie. Den är uppbyggd av två membran, ett yttre och ett inre, där det inre omger det proteinrika innandömet som kallas matrix. I matrix finns vattenlösliga enzymer som bryter ner organiska syror till koldioxid. Under denna process överförs energirika elektroner till NAD+, som reduceras och bildar NADH. I det inre membranet finns elektrontransportkedjan som består av ett antal membranbundna enzymer. Där oxideras NADH av NADH-dehydrogenaser, varvid elektronerna sedan förs genom resten av kedjan för att slutligen reducera syre till vatten. Energin som avges från elektronerna används till att bilda ATP. När man jämför djurmitokondrier med växtmitokondrier finner man att elektrontransportkedjan i växter innehåller extra dehydrogenaser, så kallade alternativa NAD(P)H dehydrogenaser. De kan sitta både på utsidan och insidan av det inre membranet och är speciella bl a därför att de inte bidrar till att bilda ATP utan "slösar" bort energin från elektronerna i form av värme. I en del av mitt arbete har jag studerat de alternativa NAD(P)H dehydrogenaserna i växten backtrav (Arabidopsis thaliana). Backtrav är ett vanligt och oansenligt litet ogräs, men också en mycket omtyckt försöksväxt. Detta beror bl a på att den är lättodlad och växer snabbt, men framför allt därför att hela dess arvsmassa är känd. Arvsmassan består av DNA och innehåller all den information som behövs för att “bygga upp” en organism. DNA är indelat i bitar, så kallade gener, som kodar för proteiner. Genom att studera arvsmassan i Arabidopsis fann vi sju olika gener som kodar för mitokondriella alternativa NAD(P)H dehydrogenaser. Alla gener uttrycks inte samtidigt och alltid. För att en organism ska kunna fungera måste genuttrycket styras. Tidigare undersökningar har visat att genen för ett alternativt NAD(P)H dehydrogenas i potatis, nda1-genen, är ljusreglerad. I avhandlingen visar jag att det också finns en ljusreglerad gen i backtrav vars protein är mycket likt det som finns i potatis. Eftersom backtrav och potatis är avlägsna släktingar antyder detta att ljusreglering av nda-gener kan vara ett utbrett fenomen. Att genen är ljusregelerad kan betyda att den har en funktion kopplad till fotosyntesen. Vid ljus ökar mängden av NDA-protein i mitokondrien vilket betyder att mer NADH kan oxideras. Under fotosyntesen är ytterligare en process aktiv, den sk fotorespirationen. Ett av fotorespirationens enzymer bildar mycket NADH i mitokondrien och detta måste oxideras för att inte mitokondrien ska ta skada. Det är möjligt att NDA-proteinerna har en roll i oxidationen av detta NADH. Funktionen av de alternativa NAD(P)H dehydrogenaserna är till största delen okänd och man kan fråga sig varför växten är utrustad med energislösande enzymer. Ett sätt att se på saken är att betrakta växternas öde att vara rotade på den plats där den en gång grott och inte likt djur kunna fly undan för t ex värme, kyla, skadeinsekter eller översvämningar. Ett sätt att ändå klara sig, vilket växterna bevisligen gör, kan vara att på biokemisk nivå ha alternativa system för att kunna variera sin ämnesomsättning efter rådande omständigheter. De alternativa NAD(P)H dehydrogenaserna kan ingå i ett sådant system. För att se hur dessa enzymer påverkas av stress gjorde vi två experiment på potatisplantor där de utsattes för kyla eller för det mitokondriella giftet antimycin A. Vid köldbehandling visade det sig att NDA-proteinet nedreglerades och att aktiviteten av detta enzym minskade. I kyla minskar också fotorespirationen och därmed produktionen av fotorespiratoriskt NADH. Om NDA proteinet är involverat i att oxidera detta kan det kanske förklara nedregleringen. NDA aktiviteten minskade också efter behandlingen med antimycin A. Kyla och antimycin A har visat sig orsaka produktion av fria radikaler i mitokondrien. Fria radikaler är mycket skadliga, och är i människor t ex inblandade i uppkomsten av cancer. På liknande sätt är de skadliga för växtcellen och minskningen av NDA-aktiviteten kan kanske vara ett sätt för mitokondrien att begränsa bildningen av dessa. För att kunna tolka resultaten av t ex olika behandlingar är det viktigt att kunna mäta NAD(P)H dehydrogenaserna på ett så bra sätt som möjligt. I detta syfte isoleras mitokondrierna från växten för att man exklusivt ska kunna mäta aktiviteter som härrör från respirationen och inte från andra processer i cellen. I potatisknölar är detta relativt enkelt. Genom att homogenisera potatisarna i en vanlig råsaftcentrifug erhåller man cellvätskan som innehåller mitokondrierna. Vätskan centrifugeras sedan hårt för att mitokondrierna ska sedimentera. Därefter mäts mitokondriella aktiviteter i en syrgaselektrod som registrerar mitokondriernas syrgaskonsumtion. NAD(P)H dehydrogenas-aktiviteten mäter man genom att tillsätta NAD(P)H till mitokondrierna. Om mitokondrierna är hela kan bara de yttre NAD(P)H dehydrogenaserna mätas. Detta beror på att det inre membranet är ogenomträngligt för NAD(P)H och därför inte når de inre NAD(P)H dehydrogenaserna. För att kringgå detta problem brukar man använda metoder som tar sönder det inre membranet. Tyvärr kan detta förfarande också medföra att elektrontransportkedjan tar skada. I avhandlingen presenteras en bättre metod att komma åt och mäta de inre NADH dehydrogenaserna genom att använda substansen alamethicin. Alamethicin gör tillräckligt stora hål i membranet för att NADH ska kunna komma igenom utan att göra någon större skada på mitokondriens struktur. Genom att använda alamethicin för att "göra hål" i det inre membranet uppmätte vi högre interna NADH dehydrogenas-aktiviteter än vad som tidigare erhållits med andra metoder. Detta gör alamethicin till ett bättre redskap för att bestämma NADH dehydrogenas-aktiviteter och i förlängningen att hjälpa till att förstå de alternativa NAD(P)H dehydrogenasernas fysiologiska funktion.